RT info:eu-repo/semantics/masterThesis
T1 Edición génica bialélica mediante inserción autocatalítica de Crispr/Cas9. deleción del canal de potasio Kv1.3 como modelo
A1 Fernández Pelayo, Adriana Uxoa
A2 Universidad de Valladolid. Instituto de Biología y Genética Molecular (IBGM)
K1 Doble hélice de DNA
K1 Nucleasas
AB Desde el descubrimiento de la doble hélice de DNA, las tecnologías para sintetizar y modificar el DNA han permitido grandes avances en biología. Sin embargo, la modificación específica del genoma sigue siendo un reto1. Con este propósito se desarrollaron ciertas estrategias como las nucleasas con dedos de zinc (ZFN, Zinc Finger Nucleases)2 ,3,4 y las nucleasas TALEN (Transcription Activator-like Effector Nucleases)5,6,7 utilizando los principios de reconocimiento de DNA por proteínas. Sin embargo, las dificultades de diseño, síntesis y validación de las proteínas efectoras eran una barrera para la adopción generalizada de estas nucleasas de síntesis para uso rutinario8.Desde hace solo unos pocos años ha aparecido una nueva estrategia, el sistema CRISPR/Cas9 que ya se ha convertido en una herramienta muy útil de ingeniería genética combinando los fundamentos de las nucleasas y el reconocimiento específico de secuencias de DNA mediante pequeños oligonucleótidos de RNA. Las siglas de CRISPR provienen de Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, es decir, Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas, y Cas9 es una de las proteínas de la familia de las nucleasas que está asociada a CRISPR, por lo que su nombre proviene de CRISPR Associated System (es decir Sistema Asociado a CRISPR)9.La tecnología CRISPR/Cas9 de uso actual se basa en el sistema bacteriano CRISPR/Cas tipo II, que proporciona a las bacterias inmunidad adquirida frente a virus y plásmidos, dotándoles de protección ante elementos génicos extraños10. El sistema CRISPR/Cas de las bacterias funciona como un proceso de múltiples etapas. Primero se detectan pequeños fragmentos de ácidos nucleicos exógenos que provienen de la infección con fagos o plásmidos, y a continuación se incorporan en el genoma huésped entre repeticiones cortas de DNA. Estas secuencias se transcriben a RNA, y junto con proteínas Cas del huésped, reconocen y destruyen o silencian mediante cortes los ácidos nucleicos invasores que entran de nuevo en la bacteria, es decir, aparece una respuesta a modo de memoria inmune11. Este mecanismo de integración del DNA exógeno en el DNA huésped es una gran ventaja evolutiva puesto que la inmunidad adquirida debida a esta integración es transmitida a la descendencia12. Aun y todo, el aspecto clave de este descubrimiento ha sido su traslación a la ingeniería genética en eucariotas, ya que supone un mecanismo revolucionario de reconocimiento y escisión del DNA en sitios específicos del genoma, mecanismo que se describe en los siguientes párrafos.La proteína Cas9 es una endonucleasa que forma un complejo riboproteico con dos RNAs de cadena sencilla no codificantes (tracrRNA: crRNA) sirviendo crRNA como secuencia de guía para asociarse por complementariedad de bases con secuencias diana de DNA, permitiendo que Cas9 genere una escisión de la doble hebra de DNA en un sitio especifico. El doble RNA tracrRNA: crRNA se rediseñó más tarde como una única molécula quimérica denominada RNA guía (gRNA) permitiendo la expresión simultánea junto con la proteína Cas9. Este gRNA mantiene dos características: una secuencia de unos 20 nucleotidos (nt) en el extremo 5´ que determina el apareamiento de DNA con la secuencia diana; y una secuencia de RNA en el extremo 3´ que adopta una estructura secundaria peculiar y que se une a la proteína Cas9 (ver figura 1). De esta forma se creó un sistema sencillo de dos componentes (la proteína Cas9 y el gRNA) en el que se podía cambiar la secuencia guía de gRNA, para que la Cas9 pueda dirigirse a cualquier secuencia de DNA de interés13. La única limitación del sistema es que el DNA diana debe poseer una pequeña secuencia que sigue inmediatamente 3‘ a la secuencia de complementariedad de gRNA y que se conoce con el nombre de PAM (del inglés Protospacer Adjacent Motif) que es indispensable para que las proteína Cas9 corte la secuencia diana14 (ver figura 1). La secuencia de PAM varía en tamaño y composición de nucleótidos, en diferentes cepas bacterianas de las que se han aislado las proteínas Cas9. Por ejemplo el PAM que requiere la proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas) es 5'-NGG-3'15. De todas formas estos sitios se encuentran con bastante frecuencia en el genoma, tan a menudo como cada 8 pb16. SpCas proviene de la cepa SF370 y es la más comúnmente utilizada y la que mejor se conoce.
YR 2017
FD 2017
LK http://uvadoc.uva.es/handle/10324/26296
UL http://uvadoc.uva.es/handle/10324/26296
LA spa
DS UVaDOC
RD 26-abr-2024