Búsqueda y caracterización de moléculas de interacción específica frente a marcadores terapéuticos y aplicación en la construcción de vectores farmacológicos basados en recombinámeros tipo elastina

Abstract

Los recombinámeros de tipo elastina (ELRs) son una familia de biopolímeros proteicos producidos mediante técnicas de ADN recombinante, inspirados en la elastina natural y cuyas propiedades (biocompatibilidad, capacidad de autoensamblado, comportamiento inteligente) han permitido su aplicación en distintos campos biomédicos, entre ellos, liberación dirigida y controlada de fármacos o agentes génicos, que es en el que se centra el proyecto. Los ELRs pueden formar micro- o nanopartículas mediante autoensamblado y de esta manera encapsular fármacos o formar poliplexos (complejos polímero-ADN) con ácidos nucleicos. Su direccionamiento se puede llevar a cabo mediante fusión recombinante de los ELRs a fragmentos de anticuerpo (conservan el sitio de unión al antígeno), como scFv, o mediante conjugación química con aptámeros (ssRNA o ssDNA seleccionados por su unión específica a una diana). Este trabajo se enmarca en el desarrollo de vectores farmacológicos para la enfermedad de Chagas y para el cáncer de mama, a partir de las combinaciones ELR/aptámero y ELR/scFv. Respecto a la primera enfermedad, se sintetizó mediante transcripción in vitro el aptámero 68 (ssRNA), identificado como una molécula de interacción específica con tripomastigotes de Trypanosoma cruzi. Su caracterización mediante electroforesis en condiciones nativas y desnaturalizantes permitió conocer que el tamaño del aptámero era el adecuado, así como su elevada resistencia a la desnaturalización en relación al control, indicando la formación de múltiples interacciones intra-catenarias. Su aplicación es la conjugación química a ELRs capaces de encapsular fármacos, para dirigirlos al sitio diana y mejorar la eficacia de los principios activos disponibles para la enfermedad de Chagas. En relación al cáncer de mama, el trabajo se encuadra en la investigación de una terapia génica dirigida basada en ELRs. En el laboratorio se ha diseñado y clonado el ELR P12VOKx72, formado por la fusión recombinante del ELR (VPGKG)x72 al fragmento de anticuerpo scFv(P12), que se une específicamente a la tenascina-C, una proteína que se sobreexpresa en procesos tumorales. VOKx72 se ha combinado previamente con otras moléculas para transportar genes suicidas de forma dirigida, con prometedores resultados in vitro. En este trabajo se produjo de forma recombinante el ELR P12VOKx72, se purificó mediante cromatografía de afinidad IMAC y su caracterización mediante western-blot y espectrometría de masas MALDI-TOF demostró que una fracción del ELR se degradaba a nivel de scFv(P12). Dentro de la misma línea, el último objetivo consistía en la evaluación mediante QCM-D (Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Monitoring) de la interacción entre la tenascina-C y el aptámero TN-9.4, que se había detectado como molécula de unión específica a esta proteína y cuya aplicación es la conjugación química con VOKx72 para la construcción de una alternativa a P12VOKx72. El aptámero se inmovilizó sobre la superficie del sensor junto a una molécula espaciadora (6-mercapto-1-hexanol, MCH). La masa y el espesor de la película de tenascina-C formada sobre la capa TN-9.4:MCH, en relación a los controles negativos, sugiere que la interacción es específica.