Alteraciones de splicing del gen BRCA2 en cáncer de mama y ovario: Diseño del nuevo vector de splicing pSAD para la construcción de minigenes híbridos.

Abstract

Introducción: El splicing es el proceso de maduración de ARNm previo a la traducción, en el que los intrones son eliminados del precursor de ARNm y los exones unidos de forma secuencial. La regulación de este proceso depende de múltiples y diferentes señales e implica diferentes macrocomplejos proteicos como el espliceosoma. Las alteraciones en el proceso de splicing han demostrado ser un importante mecanismo de patogenicidad en la gran mayoría de enfermedades de etiología genética, por lo que su conocimiento resulta de gran importancia en la práctica clínica. El objetivo central de este trabajo fue el estudio de la correlación entre alteraciones de splicing del gen supresor de tumores BRCA2 y la susceptibilidad hereditaria a cáncer de mama y ovario. Material y Métodos: 333 variantes de ADN detectadas en pacientes, entre las que se incluyen tres detectadas en el programa de prevención del cáncer de Castilla y León y 300 registradas en la base de datos BIC fueron analizadas mediante una estrategia combinada, que consiste en la utilización de diversas herramientas bioinformáticas junto con ensayos funcionales de ARN de linfocitos y/o minigenes híbridos. Asimismo, se han aplicado novedosas soluciones tecnológicas como la creación de un nuevo vector de splicing pSAD o la cuantificación relativa de isoformas de splicing a través de la detección de transcritos mediante electroforesis capilar. Setenta y nueve variantes seleccionadas fueron reproducidas mediante mutagénesis dirigida en los minigenes wild type y ensayados funcionalmente en células eucariotas. Resultados: Se construyeron un total de cinco minigenes: dos en pSPL3: el MGBR2 19-20 que incluía los exones 19, 20 y sus regiones intrónicas adyacentes y el MGBR2 23-24 con los exones 23 y 24; tres en pSAD, el MGBR2 2-9 que incluye los exones 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9 y regiones intrónicas colindantes, el MGB2 16-20 con los exones 16, 17, 18, 19 y 20 y por último el MGB2 19-27 que contiene los exones 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, y 27 que además sustituyó a parte de exón V2 del vector. Un total de 33 variantes de 79 seleccionadas más 6 generadas de forma artificial con el fin de identificar elementos reguladores de splicing, alteraron el proceso de splicing. Ocho variantes alteraron el splicing en el exón 19 y sus regiones intrónicas flanqueantes (c.8378C>A, c.8486A>T, c.8486A>C, c.8487G>A, c.8487+1G>A, c.8487+3A>G, c.8487+3A>C y c.8487+3A>T), tres en el exón 20 (c.8488-2A>G, c-8488-1G>A y c.[8609A>G;8611G>T], nueve en el exón 23 (c.8954-3C>G, c.8954-1_8955delinsAA, c.8969G>A, c.9006A>T, c.[8972G>A;9006A>T], c.9076C>T, c.9117G>A, c.9117+1G>T, c.9117+1G>A), cuatro en el exón 24 (c.9118-2A>G, c.9248_9256+7del, c.9256G>T, c.9256+1G>A), seis en el exón 21 (c.8633-24_8634del, c.8754G>A, c.8754+4A>G, c.8754+5G>A, c.8754+5G>T, c.8754+5G>C), tres en el exón 22 (c.8755-1G>A, c.8948_8953+5del, c.8953+1G>T), dos en el exón 25 (c.9257-1G>C y c.9501+3A>T), dos en el exón 26 (c.9502-12T>G y c.9502-2A>C) y dos en el exón 27 (c.9649-2A>G, c.9649-5A>G y c.9698G>T). Así mismo, se realizaron 54 microdeleciones en los exones 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, y 27 en busca de elementos reguladores de splicing exónicos. Cinco microdeleciones resultaron positivas, localizando elementos reguladores en secuencias específicas de los exones 17, 18, 19, 20 y 23. Los minigenes de gran tamaño permiten mantener el contexto genómico natural donde se producen las reacciones de splicing. De hecho, en la mutación c.8488-1G>A se consiguen reproducir los patrones de splicing alterados obtenidos en muestras de paciente. Discusión: Los resultados obtenidos en este estudio aportan luz sobre el mecanismo de patogenicidad relacionado con la alteración del splicing de las variantes de ADN estudiadas. En este sentido, podemos afirmar que una importante fracción de variantes de ADN está asociada con splicing anómalo del gen BRCA2.