Importancia del perfil inflamatorio-molecular en la infección por SARS-COV-2 y su relación con el grupo sanguíneo ABO.

Abstract

INTRODUCTION The emergence of SARS-CoV-2 in China in December 2019 along with its worldwide spread, has generated a need for knowledge about this new viral infection. In our country, official national data as of March 25, 2020 recorded 47,610 diagnosed cases with 3,434 deaths, assuming a mortality rate of 7.21%. Initial studies associated dysregulation of the immune response with cytokine hypersecretion, marked lymphopenia, prothrombotic status and endothelitis. The mechanism of viral replication was also beginning to be detailed, with ACE2 appearing to be, as in SARS-CoV, the host cell receptor employed by the virus. In addition, at that time the ABO blood group began to be related to susceptibility and severity of infection. Blood group A associates intrinsic prothrombotic and inflammatory characteristics, aspects superimposable to the clinical presentation of the new SARS-CoV-2 infection. On the other hand, the polyspecificity of natural antibodies to various antigens in humans is widely known. However, while a relationship between the ABO system and novel SARS-CoV-2 seemed reasonable, the lack of knowledge and the need for specific studies on this interaction were necessary. To this end, new investigations were required that included a larger sample size, the analysis of several evolutionary moments in the course of hospital admission, and the analysis of a broad set of biomarkers related to the immune response.

OBJECTIVE To study the inflammatory-molecular response of SARS-CoV-2 infection in order to identify diagnostic and prognostic biomarkers and to evaluate the involvement of ABO blood group in the modulation of this inflammatory response, susceptibility and severity of this infection. METHODOLOGY Prospective and consecutive study of 108 COVID-19 patients admitted to the Hospital Clínico Universitario de Valladolid (Spain) who were recruited between March 24 and April 11, 2020. In addition, 28 healthy controls were also included. Using Luminex technology, plasma from controls and each patient was analyzed in duplicate at admission and 6 days after hospital stay to quantify 45 soluble mediators (45-plex Human XL Cytokine Luminex Performance Panel (R&D) kit). ABO blood typing was performed on a fully automated analyzer (Erytra® Automated System for Blood Typing) using DG Gel® cards. The study was approved by the Hospital's Clinical Ethics Committee (cod: PI 20-1717). Both the statistical package IBM SPSS Statistics Software (SPSS) version 25 and the statistical package R version 4.0.2 (R Core Team; Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria) were used for statistical analyses.

RESULTS - Article 1: Patients with COVID-19 showed different levels in multiple cytokines compared to control patients. IP-10 accurately identified patients requiring hospital admission [AUC: 0.962; 95%CI (0.933-0.992); p<0.001]. Results were validated in an independent cohort by multivariate analysis [OR: 25.573; 95%CI (8.127-80.469); p<0.001] and AUROC [AUC: 0.900; 95%CI (0.846-0.954); p<0.001]. In addition, plasma IP-10 levels above 173.35 pg/mL identified COVID-19 with higher sensitivity (86.20%) than the first SARS-CoV-2 PCR. - Article 2: High HGF levels were associated with critically ill patients [OR: 3.51; 95%CI (1.95-6.33); p<0.001]. In addition, elevated IL-1&#945; [OR: 1.36; 95%CI (1.07-1.73; p=0.01] and low IL-27 levels [OR: 0.58; 95%CI (0.39-0.85); p<0.005] significantly increased the risk of termination in the severe group. This model was especially sensitive in predicting the critically ill patient [AUC: 0.794; specificity: 69.74%; sensitivity: 81.25%). Elevation of HGF and IL-1&#945; was also significant in survival analysis (p=0.033 and p=0.011, respectively). - Article 3: Blood group A patients had a higher Charlson comorbidity index (p=0.037), higher rate of lymphopenia (p=0.039) and thrombopenia (p=0.014), as well as higher hospital mortality (p=0.044). Blood group A was an independent factor associated with Charlson index [B: 0.582, 95%CI (0.02-1.14), p=0.041].

- Article 4: The cornerstone of the ABO system involved in susceptibility and severity to SARS-CoV-2 infection is its natural anti-A and anti-B antibodies. They are able to interfere with the binding between the S protein of the virus and ACE2 (host cell receptor), which confers protection to patients with natural antibodies (blood group O). Natural antibody titers and IgG isotype may also be determinants of susceptibility. In addition, the elderly population is associated with a worse evolution given the decrease in antibodies and the positive regulation of ACE2 expression during senescence. - Article 5: Blood group O had a 2-fold lower risk of requiring mechanical ventilation or death at 28 days (log rank: p=0.042). At admission, all statistically significant cytokine levels, except HGF, were higher in blood group O patients, while at 6 days of admission they showed a significant decrease, between 20% and 40%. In contrast, the A/B/AB group showed a maintenance of cytokine levels over time. HGF showed a significant association with the risk of intubation or mortality in non-O blood group [OR: 4.229, 95%CI (2.064-8.665), p<0.001] and was also the only biomarker of poor prognosis in O blood group patients [OR: 8.852, 95%CI (1.540-50.878), p=0.015]. At hospital admission, higher cytokine levels in blood group O were associated with a better prognosis.

CONCLUSIONS In SARS-CoV-2 infection, the study of the inflammatory-molecular profile together with the involvement of ABO blood group has identified diagnostic markers (IP-10), prognostic markers (HGF, IL-1&#945; and IL-27) and delved into the role played by ABO system antibodies in the modulation of the immune response (blood group O associates higher cytokine elevation that condition a better prognosis). The main conclusions derived from the different research works carried out have been the following: 1. IP-10 was identified as a robust marker in the early detection of SARS-CoV-2 infection in hospitalized patients. 2. Elevated levels of HGF and IL-1, along with decreased IL-27 were strongly associated with disease severity and were excellent predictors of poor prognosis. In fact, IL-1 and HGF were also biomarkers of mortality. 3. In the setting of SARS-CoV-2 infection, blood group A was associated with a higher Charlson comorbidity index as well as higher hospital-level mortality. 4. Blood group O was associated with lower hospital admission rates and lower risk of intubation or mortality. 5. Natural anti-A and B antibodies of the ABO system interfere by hindering the binding between SARS-CoV-2 protein S and host cell ACE2, conferring lower susceptibility and severity to patients of blood group O. 6. The better prognosis in blood group O was associated with significantly higher levels of all cytokines analyzed at admission (except HGF) with a consequent decrease at 6 days of hospital stay, not evidenced in other blood groups. 7. The plasma concentration of antibodies, the relevance of the IgG isotype in blood group O and the positive regulation of ACE2 expression together with the decrease of immunoglobulins in senescence, are other determinants in the severity of infection.

INTRODUCCIÓN La aparición del SARS-CoV-2 en China en diciembre de 2019 junto con su expansión mundial, ha generado una necesidad de conocimiento acerca de esta nueva infección viral. En nuestro país, los datos nacionales oficiales a 25 de marzo de 2020 registraban 47.610 casos diagnosticados con 3.434 fallecidos, suponiendo una tasa de mortalidad del 7,21%. Estudios iniciales asociaron una disregulación de la respuesta inmunitaria con hipersecreción de citoquinas, una linfopenia marcada, un estatus protrombótico y una endotelitis. Se empezaba a detallar también el mecanismo de replicación viral, pareciendo ser la ACE2, al igual que en el SARS-CoV, el receptor de la célula huésped empleado por el virus. Además, en ese momento el grupo sanguíneo ABO comenzó a relacionarse con la susceptibilidad y severidad a la infección. El grupo sanguíneo A asocia unas características intrínsecas protrombóticas e inflamatorias, aspectos superponibles a la presentación clínica de la nueva infección por SARS-CoV-2. Por otro lado, la poliespecificidad de los anticuerpos naturales a antígenos diversos en el ser humano es ampliamente conocida. Sin embargo, pareciendo razonable una relación entre el sistema ABO y el nuevo SARS-CoV-2, el desconocimiento y necesidad de estudios específicos sobre esta interacción eran necesarios. Para ello, se requerían nuevas investigaciones que incluyesen un mayor tamaño muestral, el análisis de varios momentos evolutivos en el transcurso del ingreso hospitalario y el análisis de un amplio conjunto de biomarcadores relacionados con la respuesta inmunitaria.

OBJETIVO Estudiar la respuesta inflamatoria-molecular de la infección por SARS-CoV-2 para identificar biomarcadores diagnósticos, pronósticos y evaluar la implicación del grupo sanguíneo ABO en la modulación de esta respuesta inflamatoria, la susceptibilidad y la gravedad de esta infección. METODOLOGÍA Estudio prospectivo y consecutivo de 108 pacientes COVID-19 ingresados en el Hospital Clínico Universitario de Valladolid (España) que fueron reclutados entre el 24 de marzo y el 11 de abril de 2020. Además, también se incluyeron 28 controles sanos. Mediante tecnología Luminex se analizó, por duplicado, el plasma de los controles y cada paciente al ingreso y a los 6 días de estancia hospitalaria para cuantificar 45 mediadores solubles (kit 45-plex Human XL Cytokine Luminex Performance Panel (R&D)). La determinación del grupo sanguíneo ABO se realizó en un analizador completamente automatizado (Erytra® Automated System for Blood Typing) usando tarjetas DG Gel®. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética Clínica del Hospital (cod: PI 20-1717). Para los análisis estadísticos se emplearon tanto el paquete estadístico Software IBM SPSS Statistics (SPSS) versión 25 como el paquete estadístico R versión 4.0.2 (R Core Team; Foundation for Statistical Computing, Viena, Austria).

RESULTADOS - Artículo 1: Los pacientes con COVID-19 mostraron diferentes niveles en múltiples citoquinas en comparación con los pacientes control. La IP-10 identificó con precisión a pacientes que requirieron ingreso hospitalario [AUC: 0,962; IC95% (0,933&#8211;0,992); p<0,001]. Los resultados fueron validados en una cohorte independiente mediante análisis multivariante [OR: 25.573; 95%CI (8.127&#8211;80.469); p<0.001] y AUROC [AUC: 0.900; 95%CI (0.846&#8211;0.954); p<0.001]. Además, niveles plasmáticos de IP-10 superiores a 173,35 pg/mL identificaron el COVID-19 con mayor sensibilidad (86,20%) que la primera PCR de SARS-CoV-2. - Artículo 2: Altos niveles de HGF se asociaron con pacientes críticos [OR: 3,51; IC95% (1,95&#8211;6,33); p<0,001]. Además, la elevación de la IL-1&#945; [OR: 1,36; IC95% (1,07&#8211;1,73; p=0,01] y niveles bajos de IL-27 [OR: 0,58; IC95% (0,39&#8211;0,85); p<0,005] aumentaron considerablemente el riesgo de terminar en el grupo severo. Este modelo fue especialmente sensible para predecir al paciente crítico [AUC: 0,794; especificidad: 69,74%; sensibilidad: 81,25%). La elevación de la HGF y la IL-1&#945; también resultó significativa en el análisis de supervivencia (p=0,033 y p=0,011, respectivamente). - Artículo 3: Los pacientes del grupo sanguíneo A tuvieron un mayor índice de comorbilidad de Charlson (p=0,037), mayor tasa de linfopenia (p=0,039) y trombopenia (p=0,014), así como mayor mortalidad hospitalaria (p=0,044). El grupo sanguíneo A fue un factor independiente asociado con el índice de Charlson [B: 0,582, IC95% (0,02&#8211;1,14), p=0,041]. - Artículo 4: La piedra angular del sistema ABO involucrada en la susceptibilidad y gravedad a la infección por SARS-CoV-2 son sus anticuerpos naturales anti-A y anti-B. Son capaces de interferir en la unión entre la proteína S del virus y la ACE2 (receptor de la célula huésped), lo que confiere protección a los pacientes con anticuerpos naturales (grupo sanguíneo O). Los títulos de anticuerpos naturales y el isotipo IgG pueden ser también determinantes en la susceptibilidad. Además, la población anciana está asociada a una peor evolución dado el descenso de anticuerpos y la regulación positiva de la expresión de ACE2 durante la senescencia. - Artículo 5: El grupo sanguíneo O presentó un riesgo dos veces inferior de requerir ventilación mecánica o fallecer a los 28 días (log rank: p=0,042). Al ingreso, todos los niveles de citoquinas estadísticamente significativos, excepto HGF, fueron más altos en los pacientes del grupo sanguíneo O, mientras que, a los 6 días de ingreso mostraron un descenso significativo, entre 20% y 40%. Por el contrario, el grupo A/B/AB presentó un mantenimiento de los niveles de citoquinas a lo largo del tiempo. HGF mostró una asociación significativa con el riesgo de intubación o mortalidad en el grupo sanguíneo no-O [OR: 4,229, IC95% (2,064&#8211;8,665), p<0,001] y también fue el único biomarcador de mal pronóstico en pacientes del grupo sanguíneo O [OR: 8,852, IC95% (1,540&#8211;50,878), p=0,015]. Al ingreso hospitalario, los mayores niveles de citoquinas en el grupo sanguíneo O asociaron un mejor pronóstico.

CONCLUSIONES En la infección por SARS-CoV-2, el estudio del perfil inflamatorio-molecular junto con la implicación del grupo sanguíneo ABO ha identificado marcadores diagnósticos (IP-10), pronósticos (HGF, IL-1&#945; e IL-27) y ahondado en el papel que juegan los anticuerpos del sistema ABO en la modulación de la respuesta inmune (grupo sanguíneo O asocia mayor elevación de citoquinas que condicionan un mejor pronóstico). Las principales conclusiones derivadas de los diferentes trabajos de investigación realizados han sido las siguientes: 1. Se identificó la IP-10 como un marcador robusto en la detección precoz de la infección por SARS-CoV-2 en pacientes hospitalizados. 2. Elevados niveles de HGF e IL-1, junto con el descenso de la IL-27 estaban fuertemente asociados con la gravedad de la enfermedad y fueron excelentes predictores de mal pronóstico. De hecho, IL-1 y HGF eran también biomarcadores de mortalidad. 3. En el contexto de una infección por SARS-CoV-2, el grupo sanguíneo A se asoció con un mayor índice de comorbilidad de Charlson así como con una mayor mortalidad a nivel hospitalario. 4. El grupo sanguíneo O asoció menores tasas de ingreso hospitalario y menor riesgo de intubación o mortalidad. 5. Los anticuerpos naturales anti-A y B del sistema ABO interfieren dificultando la unión entre la proteína S del SARS-CoV-2 y la ACE2 de la célula huésped, confiriendo una menor susceptibilidad y gravedad a los pacientes de grupo sanguíneo O. 6. El mejor pronóstico en el grupo sanguíneo O se asoció con niveles significativamente mayores de todas las citoquinas analizadas al ingreso (excepto la HGF) con un consiguiente descenso a los 6 días de estancia hospitalaria, no evidenciado en otros grupos sanguíneos. 7. La concentración plasmática de los anticuerpos, la relevancia del isotipo IgG en el grupo sanguíneo O y la regulación positiva de la expresión de la ACE2 junto con el descenso de las inmunoglobulinas en la senescencia, son otros determinantes en la severidad de la infección. &#8195;