Hepatic insulin-degrading enzyme regulation and its role on glucagon signaling

Abstract

Insulin-degrading enzyme (IDE) is a highly conserved and ubiquitously expressed Zn2+-metalloendopeptidase that degrades insulin and glucagon among other substrates. By decades, its main function has been attributed to hepatic insulin clearance, a process that regulates availability of circulating insulin levels, but recent studies performed by our group indicate a more important role of this protein regulating hepatic insulin sensitivity and glucose homeostasis. However, its regulation in response to nutritional state and the fasting-to-postprandial transition is poorly understood and much less attention has been dedicated to its role on regulating glucagon signal transduction and mitochondrial function in hepatocytes. In this thesis, we studied the regulation of IDE mRNA and protein levels as well as its proteolytic activity in the liver under fasting (18 h) and refeeding (30 min and 3 h) conditions, in mice fed a standard (SD) or high-fat (HFD) diets. Likewise, we aim to elucidate the role of IDE on glucagon signaling and its impact on energy metabolism in hepatocytes using a loss-of-function approach. Livers from L-IDE-KO and WT mice were used to obtain tissue extracts and primary hepatocytes for culture. The mouse hepatocyte cell line (AML12) was transduced with an shRNA targeting Ide mRNA by means of a lentiviral vector and obtaining a stable line (AML12-shRNA-IDE). L-IDE-KO primary hepatocytes and AML12-shRNA-IDE with their respective controls were stimulated with glucagon and the signaling pathway was analyzed by western blot and ELISA. Mitochondrial function and energy metabolism of AML12-shRNA-IDE and control cells were assessed by Seahorse XFe24 Analyzer with a Mito Stress Assay. In the liver of mice fed a HFD, fasting reduced IDE protein levels (~30%); whereas refeeding increased its activity (~45%) in both mice fed an SD and HFD. Circulating lactate concentrations directly correlated with hepatic IDE activity and protein levels. Of note, L-lactate in liver lysates augmented IDE activity in a dose-dependent manner. Additionally, IDE protein levels in liver, but not its activity, inversely correlated (R2 = 0.3734, p < 0.01) with a surrogate marker of insulin resistance (HOMA index). Liver extracts and primary hepatocytes from L-IDE-KO mice, compared to WT, showed decreased expression of glucagon receptor (~60%), CREB protein (~40%), and diminished phosphorylation of CREB (~50%) upon glucagon stimulation. Ide expression and IDE protein levels were reduced by ~50% in AML12-shRNA-IDE cells. At basal state, glucagon receptor, FoxO1 and CREB protein were significantly lower in AML12-shRNA-IDE cells than in control cells, (~40%, ~75% and ~75%, respectively). Glucagon stimulation resulted in less (~30%) cAMP levels and changes in the kinetic of glucagon-mediated phosphorylation of CREB and other PKA substrates in AML12-shRNA-IDE. Seahorse analyses showed that both oxygen consumption and extracellular acidification rates increased 2-fold in AML12-shRNA-IDE with a 2-fold increment of mitochondrial and glycolytic adenosine triphosphate (ATP) production. Finally, we generated, using homology modeling by satisfaction of spatial restrains technique, complete 3D structures of human and murine IDE isoforms with 15a and 15b exons. Our results highlight that the nutritional regulation of IDE in liver is more complex than previously expected in mice. Reduced IDE expression in mouse hepatocytes has a deleterious effect on glucagon signaling, affecting this intracellular pathway in parallel with a shift to a more energetic phenotype. These findings suggest that IDE is necessary for proper glucagon signal transduction and regulation of the energy production in hepatocytes.

La enzima degradadora de insulina (IDE) es una Zn2+-metaloendopeptidasa altamente conservada y expresada de forma ubicua que degrada la insulina y el glucagón, entre otros sustratos. Durante décadas, se ha atribuido su función principal al aclaramiento de insulina hepática, proceso que regula la disponibilidad de los niveles de insulina circulante, pero estudios recientes realizados por nuestro grupo indican un papel más importante de esta proteína en la regulación de la sensibilidad a la insulina hepática y la homeostasis de la glucosa. Sin embargo, su regulación en respuesta al estado nutricional y la transición de ayuno a posprandial es poco conocida y se ha dedicado mucha menos atención a su papel en la regulación de la transducción de señales de glucagón y la función mitocondrial en los hepatocitos. En esta tesis estudiamos la regulación de los niveles de mRNA y proteína de IDE así como su actividad proteolítica en el hígado en condiciones de ayuno (18 h) y realimentación (30 min y 3 h), en ratones alimentados con un estándar (SD) o alto dietas ricas en grasas (HFD). Asimismo, nuestro objetivo es dilucidar el papel de IDE en la señalización de glucagón y su impacto en el metabolismo energético en los hepatocitos utilizando un enfoque de pérdida de función. Se usaron hígados de ratones L-IDE-KO y WT para obtener extractos de tejido y hepatocitos primarios para cultivo. La línea celular de hepatocitos de ratón (AML12) se transdujo con un shRNA dirigido a Ide mRNA mediante un vector lentiviral y se obtuvo una línea estable (AML12-shRNA-IDE). Los hepatocitos primarios L-IDE-KO y AML12-shRNA-IDE con sus respectivos controles se estimularon con glucagón y la vía de señalización se analizó mediante western blot y ELISA. La función mitocondrial y el metabolismo energético de AML12-shRNA-IDE y las células de control se evaluaron mediante Seahorse XFe24 Analyzer con un Mito Stress Assay. En el hígado de ratones alimentados con HFD, el ayuno redujo los niveles de proteína IDE (~30%); mientras que la realimentación aumentó su actividad (~45%) en ambos ratones alimentados con SD y HFD. Las concentraciones de lactato circulante se correlacionaron directamente con la actividad hepática de IDE y los niveles de proteína. Es de destacar que el L-lactato en los lisados ​​de hígado aumentó la actividad de IDE de una manera dependiente de la dosis. Además, los niveles de proteína IDE en el hígado, pero no su actividad, se correlacionaron inversamente (R2 = 0,3734, p < 0,01) con un marcador sustituto de resistencia a la insulina (índice HOMA). Los extractos de hígado y hepatocitos primarios de ratones L-IDE-KO, en comparación con WT, mostraron una expresión reducida del receptor de glucagón (~60 %), la proteína CREB (~40 %) y una fosforilación disminuida de CREB (~50 %) tras la estimulación con glucagón . La expresión de ide y los niveles de proteína IDE se redujeron en ~ 50% en células AML12-shRNA-IDE. En el estado basal, el receptor de glucagón, FoxO1 y la proteína CREB fueron significativamente más bajos en las células AML12-shRNA-IDE que en las células de control (~40 %, ~75 % y ~75 %, respectivamente). La estimulación con glucagón resultó en menos (~ 30 %) niveles de cAMP y cambios en la cinética de la fosforilación mediada por glucagón de CREB y otros sustratos de PKA en AML12-shRNA-IDE. Los análisis de caballitos de mar mostraron que tanto el consumo de oxígeno como las tasas de acidificación extracelular aumentaron dos veces en AML12-shRNA-IDE con un incremento de dos veces en la producción de trifosfato de adenosina (ATP) mitocondrial y glucolítico. Finalmente, generamos, utilizando modelos de homología mediante la técnica de satisfacción de restricciones espaciales, estructuras 3D completas de isoformas IDE humanas y murinas con los exones 15a y 15b. Nuestros resultados destacan que la regulación nutricional de IDE en el hígado es más compleja de lo esperado previamente en ratones. La expresión reducida de IDE en hepatocitos de ratón tiene un efecto nocivo sobre la señalización de glucagón, lo que afecta esta vía intracelular en paralelo con un cambio hacia un fenotipo más energético. Estos hallazgos sugieren que la IDE es necesaria para la transducción adecuada de señales de glucagón y la regulación de la producción de energía en los hepatocitos.