Análisis lipidómico de los cambios en el metabolismo lipídico que tienen lugar durante la activación de los macrófagos peritoneales de ratón por estímulos proinflamatorios

Abstract

Macrophages have been studied as one of the main sources of free AA and eicosanoids. In the presence of an inflammatory stimulus, the AA contained in membrane phospholipids is hydrolyzed to be released and subsequently metabolized to its oxygenated derivatives, which perform biological functions. In this work, the mobilization of AA and AdA from phospholipids before zymosan and its opsonized homologue is studied, as well as the role played by different phospholipases in the hydrolysis and release of said n-6 fatty acid. The results indicate that AA and AdA are mainly located in PE species, mainly in plasmalogens, although a high amount is also located in PC and PI. In the presence of zymosan, macrophages experience decreases in these last two phospholipids, without large variations in PE. However, the release of AA and AdA is higher in the presence of opsonized zymosan. In addition, selective inhibitors of the phospholipases sPLA2-V, cPLA2α and iPLA2β were used in the experiments, observing the great role that cPLA2α plays in the hydrolysis and subsequent release of AA, while both cPLA2α and iPLA2β participate in the mobilization of AdA. . This study has analyzed how, in the presence of exogenous AdA, macrophages use AA in the same way as when they are not enriched with AdA, therefore, these fatty acids do not compete with each other in inflammatory conditions. On the other hand, the reason for the lack of AA mobilization from PE species has also been analyzed. Data reported in the literature have described the lack of mobilization of said fatty acid as a continuous reincorporation of this in the PE species thanks to CoA-IT. However, in this study it is observed that, although in the presence of zymosan there is no apparent release in PE due to remodeling, decreases in levels are observed in the presence of opsonized zymosan. Thanks to studies carried out using [3H]AA labeling, it has been confirmed that remodeling in the presence of opsonized zymosan is slower and the rate of remodeling is lower than that analyzed with unopsonized zymosan. These results explain the rapid recovery of PE with AA in the presence of zymosan unlike its opsonized counterpart. Due to the great involvement reported in the literature of oxidized phospholipids in inflammatory situations, a detailed analysis of their presence in murine peritoneal macrophages is performed. For its detection, techniques with great sensitivity and reproducibility have been used, such as chromatography coupled with mass spectrometry. The results indicate an increase in the levels of oxidized phospholipids under inflammatory conditions. The hydrolysis and release of these compounds is of great importance in inflammatory situations, describing the great implication of iPLA2β since, as has been verified, its inhibition prevents the release of AAox. However, it has been observed that cPLA2α also partially participates in the synthesis of oxidized phospholipids, hydrolyzing and releasing AA, which is subsequently oxidized through the LOX enzymatic pathway. Finally, a lipidomic study of the phospholipids present in peritoneal macrophages polarized to M1 and M2 was carried out in order to find differences between both phenotypes, both in their basal and stimulated forms. Although no differences were found between both polarizations and control cells in terms of AA release under inflammatory conditions, the release of fatty acids such as AdA, DHA, DPA and EPA in activated cells was different in both phenotypes, with less release observed. and therefore, greater accumulation in the M1 phenotype.

Los macrófagos han sido estudiados como una de las principales fuentes de AA libre y de eicosanoides. En presencia de un estímulo inflamatorio, el AA contenido en los fosfolípidos de membrana se hidroliza para liberarse y posteriormente metabolizarse a sus derivados oxigenados, los cuales desempeñan funciones biológicas. En este trabajo se estudia la movilización del AA y AdA de los fosfolípidos ante zimosan y su homólogo opsonizado y que papel toman diferentes fosfolipasas en la hidrolisis y liberación de dicho ácido graso n-6. Los resultados indican que el AA y AdA se localiza prioritariamente en las especies de PE, mayoritariamente en plasmalógenos, aunque una elevada cantidad se localiza también en PC y PI. En presencia de zimosan, los macrófagos experimentan disminuciones en estos dos últimos fosfolípidos, sin grandes variaciones en PE. Sin embargo, la liberación de AA y AdA es mayor en presencia de zimosan opsonizado. Además, en los experimentos se emplearon inhibidores selectivos de las fosfolipasas sPLA2-V, cPLA2α e iPLA2β observando el gran papel que desempeña la cPLA2α en la hidrolisis y posterior liberación del AA, mientras que en la movilización del AdA participan tanto la cPLA2α y la iPLA2β. En este estudio se ha analizado cómo, en presencia de AdA exógeno, los macrófagos utilizan el AA de la misma manera que cuando estos no son enriquecidos con AdA, por lo tanto, dichos ácidos grasos no compiten entre sí en condiciones inflamatorias. Por otra parte, también se ha analizado la razón de la falta de movilización de AA de las especies de PE. Datos reportados en la bibliografía han descrito la falta de movilización de dicho ácido graso como una continua reincorporación de este en las especies de PE gracias a CoA-IT. Sin embargo, en este estudio se observa como, aunque en presencia de zimosan no hay una aparente liberación en PE a causa de la remodelación, si que se observan disminuciones en los niveles en presencia de zimosan opsonizado. Gracias a estudios hechos a partir de marcaje con [3H]AA se ha comprobado que la remodelación en presencia de zimosan opsonizado es más lenta y la tasa de remodelación es menor que la analizada con zimosan sin opsonizar. Estos resultados explican la rápida recuperación de PE con AA en presencia de zimosan a diferencia de su homólogo opsonizado. Debido a la gran implicación reportada en bibliografía de los fosfolípidos oxidados ante situaciones inflamatorias, se realiza un análisis detallado de la presencia de estos en macrófagos peritoneales murinos. Para su detección se han empleado técnicas con gran sensibilidad y reproducibilidad como es la cromatografía acoplada a la espectrometría de masas. Los resultados indican un aumento de los niveles de fosfolípidos oxidados bajo condiciones inflamatorias. La hidrólisis y liberación de estos compuestos es de gran importancia en situaciones inflamatorias, describiéndose la gran implicación de la iPLA2β ya que, como se ha podido comprobar, su inhibición impide la liberación de AAox. Sin embargo, se ha observado como la cPLA2α también participa de forma parcial en la síntesis de fosfolípidos oxidados, hidrolizando y liberando AA que posteriormente es oxidado a través de la vía enzimática LOX. Finalmente, se realizó un estudio lipidómico de los fosfolípidos presentes en macrófagos peritoneales polarizados a M1 y M2 con el fin de encontrar diferencias entre ambos fenotipos, tanto en su forma basal como estimulados. Si bien no se encontraron diferencias entre ambas polarizaciones y las células control en cuanto a la liberación de AA en condiciones inflamatorias, la liberación de ácidos grasos como AdA, DHA, DPA y EPA en células activadas, fue diferente en ambos fenotipos, observando menor liberación y por ende, mayor acumulación en el fenotipo M1.