Quantitative Detection of Clostridium tyrobutyricum in Milk by Real-Time PCR

Abstract

Desarrollamos un ensayo de PCR en tiempo real para la detección cuantitativa de Clostridium tyrobutyricum, que ha sido identificado como el principal agente causante de la hinchazón tardía en el queso. El ensayo fue 100% específico, con una sensibilidad analítica de 1 genoma equivalente en el 40% de las reacciones. La cuantificación fue lineal (R2 > 0,9995) en un rango dinámico de 5 log, hasta 10 equivalentes genómicos, con una eficacia de la PCR de >0,946. Con un tratamiento detergente optimizado y un pretratamiento enzimático de la muestra antes de la centrifugación y la extracción del ácido nucleico, el ensayo contó hasta 300 esporas de C. tyrobutyricum, con una precisión relativa de 82,98 a 107,68, y detectó tan sólo 25 esporas en 25 ml de leche cruda contaminada artificialmente o leche entera tratada a temperatura ultra alta. Este trabajo nos permitió poner a puntos metodologías de extracción de ADN en matrices complejas como el queso curado de oveja y la leche y además permitió solicitar proyectos a la convocatoria competitiva del ministerio y proyectos con empresas y laboratorios de la región en una gran y fructífera colaboración que hoy perdura con las queserías y otros problemas.