Determinación de oxilipinas mediante UHPLC-MS/MS

Abstract

Las oxilipinas son una clase de lípidos bioactivos derivados de ácidos grasos poliinsaturados, conocidos por su papel en la regulación de la inflamación y otras funciones fisiológicas cruciales como la regulación de la presión arterial. Debido a su diversidad estructural y baja abundancia en muestras biológicas, su análisis representa un desafío significativo. Tradicionalmente, los métodos de análisis de estas moléculas han incluido inmunoensayos, cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía de líquidos con detectores de matriz de diodos o fluorescencia, y electroforesis capilar con detectores de matriz de fotodiodos. Sin embargo, estos métodos han demostrado tener sensibilidades bajas y limitaciones en la precisión y especificidad. Para superar estas limitaciones, se ha desarrollado un método analítico basado en cromatografía líquida de ultra-alto rendimiento acoplada a la espectrometría de masas en tándem (UHPLC-MS/MS) con monitoreo de múltiples reacciones (MRM). Este enfoque avanzado permite la caracterización y cuantificación precisa de oxilipinas en muestras biológicas. En este contexto, se realizaron estudios específicos para la cuantificación de oxilipinas nativas y estándares internos deuterados. Se construyó una línea de calibrado con diferentes niveles de concentración para evaluar la sensibilidad, el rango lineal, el límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ). Además, se llevó a cabo la extracción en fase sólida (SPE) de sobrenadantes de células RAW 264.7 tratadas con LPS, así como de medios de cultivo dopados, para determinar el efecto matriz, la recuperación y la eficiencia del método. Este método UHPLC-MS/MS con el modo de trabajo MRM ha demostrado ser altamente sensible y preciso, con la capacidad de analizar perfiles complejos de oxilipinas en muestras biológicas, lo que abre nuevas oportunidades en el campo de la lipidómica biomédica y la investigación de procesos inflamatorios.

Oxylipins are a class of bioactive lipids derived from polyunsaturated fatty acids, known for their role in regulating inflammation and other crucial physiological functions such as blood pressure regulation. Due to their structural diversity and low abundance in biological samples, their analysis poses a significant challenge. Traditional methods for analyzing these molecules have included immunoassays, thin-layer chromatography (TLC), liquid chromatography with diode array or fluorescence detectors, and capillary electrophoresis with photodiode array detectors. However, these methods have shown low sensitivities and limitations in precision and specificity. To overcome these limitations, an analytical method based on ultra-high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) with multiple reaction monitoring (MRM) has been developed. This advanced approach allows for precise characterization and quantification of oxylipins in biological samples. In this context, specific studies were conducted for the quantification of native oxylipins and deuterated internal standards. A calibration curve was constructed with different concentration levels to evaluate sensitivity, linear range, limit of detection (LOD), and limit of quantification (LOQ). Additionally, solid-phase extraction (SPE) was performed on supernatants from LPS-treated RAW 264.7 cells and spiked culture media to assess matrix effects, recovery, and method efficiency. This UHPLC-MS/MS method with MRM has proven to be highly sensitive and accurate, capable of analyzing complex profiles of oxylipins in biological samples, thus opening new avenues in biomedical lipidomics and inflammatory process research.