Design and functionalization of nanostructures for cell-type specific delivery and intracellular tracking

Abstract

Las nanoestructuras de DNA tetraédricas (TDNs) representan una clase prometedora de nanotransportadores, debido a su alta biocompatibilidad y a la facilidad con la que pueden ser funcionalizadas para la liberación controlada y dirigida de agentes terapéuticos. Entre estos agentes se encuentran las DNAzimas, ácidos nucleicos catalíticos que están emergiendo como herramientas innovadoras para la regulación génica, gracias a su capacidad para reconocer y escindir secuencias específicas de RNA. No obstante, su potencial terapéutico aún permanece parcialmente inexplorado, especialmente en contextos clínicos y de medicina personalizada. En este trabajo, se diseñaron tres TDNs diferentes, de las cuales dos de ellas están cargadas cada una con una DNAzima específica para antagonizar dos microRNAs distintos: miR-34a, implicado en la neuroinflamación, y miR-155, un reconocido oncomiR. Ambas TDNs fueron ensambladas con éxito, y la evaluación funcional reveló que la TDN dirigida contra miR-34a mostró una internalización efectiva en células de microglía. En cambio, la TDN diseñada contra miR-155 cargada con un aptámero dirigido a MUC1 presentó una menor eficiencia de internalización en las células cancerígenas. A mayores, se desarrolló un TDN sensible a pH, con el objetivo de confirmar su capacidad para experimentar cambios conformacionales detectables mediante fluorescencia basada en FRET. Los resultados muestran cambios significativos en la emisión de fluorescencia en función del pH, lo que sugiere que esta TDN pueden actuar como sensor intracelular y aportar información valiosa sobre el tráfico intracelular y la estabilidad de las TDNs.

Tetrahedral DNA nanostructures (TDNs) are a promising class of nanocarriers due to their high biocompatibility and ease of functionalization for targeted and controlled delivery of therapeutic agents. Among these agents figure DNAzymes, catalytic nucleic acids that have emerged as innovative tools for gene regulation, owing to their ability to recognize and cleave specific RNA sequences. However, their therapeutic potential remains only partially explored, particularly in clinical Universidad de Valladolid – Grado en Biomedicina y Terapias Avanzadas - TFG and personalized medicine contexts. In this study, three different TDNs were designed, two of which were each loaded with a specific DNAzyme targeting two different microRNAs: miR-34a, involved in neuroinflammation, and miR-155, a well-characterized oncomiR. Both TDNs were successfully assembled, and functional evaluation revealed that the TDN targeting miR-34a exhibited effective internalization in microglial cells. In contrast, the TDN targeting miR-155 loaded with a MUC1-directed aptamer showed lower uptake efficiency in cancer cells. Additionally, a pH-sensitive TDN was developed to evaluate its ability to undergo conformational changes detectable through FRET-based fluorescence. The results showed significant fluorescence emission changes depending on the pH, suggesting that this TDN can act as an intracellular sensor and provide valuable insight into the TDNs trafficking and stability.