Monitorización directa de la señalización de Ca2+ en el lumen endolisosomal: nuevo sensor bioluminiscente basado en aequorina

Abstract

El Ca2+ es un segundo mensajero ubicuo y universal, indispensable en el citosol para llevar a cabo muchas de las funciones celulares, como la neurotransmisión. Además, en el lumen de los orgánulos también cumple funciones específicas para ellos. En los últimos años se le ha dado mucha importancia a los depósitos de Ca2+ de los orgánulos ácidos, ya que son capaces de acumular y liberar el ion tras la activación de canales específicos. En este sentido, el Ca2+ podría estar implicado en la autofagia, la actividad de mTOR, la fusión y fisión, la modificación de la dinámica de Ca2+ de otros orgánulos (como mitocondria y RE), o la regulación del tráfico lisosomal y su tamaño. Se ha dedicado mucho esfuerzo al desarrollo de indicadores de Ca2+ codificados genéticamente como herramientas para medir el Ca2+ luminal en compartimentos ácidos. Sin embargo, esta tarea es extremadamente compleja, ya que la mayoría de los indicadores fluorescentes de Ca2+ son sensibles al pH, extinguiéndose la señal fluorescente a pH ácido. Por el contrario, los sensores de Ca2+ basados en bioluminiscencia son potencialmente ventajosos, ya que son relativamente resistentes a las variaciones de pH. En este sentido, la aequorina es una proteína bioluminiscente de unión al Ca2+ que emite luz azul cuando se reconstituye con su cofactor celenteracina. Las aequorinas son excelentes para monitorizar la dinámica subcelular del Ca2+, pues pueden adaptarse a las diferentes concentraciones de Ca2+ y dirigirse a organelas diana de forma específica. En los últimos años el laboratorio ha estado desarrollando el indicador denominado ELGA1 dirigido al lumen endolisosomal. En esta tesis, nos planteamos medir con ELGA1 la concentración de Ca2+ luminal de organelas acídicas y su capacidad para liberar el ion ante estímulos específicos, así como determinar en qué compartimentos acídicos es capaz de medir ELGA1, consiguiendo en gran parte nuestros objetivos. Hay que tener en cuenta que existe una gran variedad de compartimentos acídicos, cuyas características se siguen perfilando en la literatura, por lo que no es tarea fácil determinar en cuáles reporta ELGA1; en esta tesis por conveniencia, para referirnos a todos los compartimentos ligeramente ácidos de nuestro interés en todas sus posibles variantes, utilizaremos el término “endolisosomas” (EL) de manera genérica (aun sabiendo que esta denominación no es del todo correcta, ya que los endolisosomas son un compartimento específico de la vía endolisosomal). Descubrimos que la aequorina se reconstituye a partir de pH 5.5, aunque en orgánulos con alta concentración de Ca2+ sólo es posible medir a partir de pH 6. En consecuencia, aprovechamos esta característica para, a través de ELGA1, describir la dinámica del Ca2+ en los EL a pH 6 y superior. Demostramos que la captación luminal de Ca2+ reportada por ELGA1 es sensible a la tapsigargina, y que los niveles de Ca2+ en estado estacionario son de 396 ± 30 µM en células HEK293T (permeabilizadas), que se reducen selectivamente tras la sobreexpresión del canal TRPML1 (canal de Ca2+ específico de endosomas tardíos y lisosomas) al estimular con ML-SA1. IP3 (agonista de IP3R) genera liberación de Ca2+ del lumen del orgánulo, mientras que al inactivar IP3R tipo 1, 2 y 3 no hay liberación. Sorprendentemente, los resultados de ELGA1 fueron muy similares a los ya conocidos del RE, a pesar de que ELGA1 se localiza en EL; y TRPML1 también generaba liberación de Ca2+ en RE, a pesar de que este canal no se localiza en dicho orgánulo, pues es específico de endosomas tardíos y lisosomas. Proponemos una posible comunicación entre estos dos orgánulos a través de TRPML1 en los sitios de contacto entre ambos, de los que se informa en la literatura.