Caracterización clínica y análisis de exoma clínico, generación y edición genética de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) de pacientes con distrofias hereditarias de la retina asociadas al gen PROM1

Abstract

Introduction: Inherited retinal dystrophies (IRD) are one of the leading causes of irreversible blindness worldwide. They are caused by mutations in genes that trigger photoreceptor degeneration and progressive vision loss. IRD affect the quality of life of patients and their families, generating a significant social impact and a constant burden on healthcare resources due to their chronic and progressive nature, especially since the vast majority currently lack of curative treatments. Moreover, their huge phenotypic and genotypic heterogeneity hinders the diagnosis and understanding of their pathophysiology. IRD associated with the PROM1 gene are a representative example of this heterogeneity. In this context, Next Generation Sequencing (NGS) has become an essential tool for studying the molecular diversity of IRD. This technology allows the analysis of specific genomic regions and the sequencing of millions of DNA fragments. Specifically, Clinical Exome Sequencing (CES) analyzes the coding regions of genes relevant to the patient's pathology, increasing the chance of identifying modifier genes. On the other hand, induced pluripotent stem cells (iPSC) have revolutionized the study of IRD pathophysiology through the development of in vitro iPSC-based disease models, particularly when combined with CRISPR/Cas9 gene-editing technology. Additionally, from a therapeutic perspective, iPSC-derived cells serve as a foundation for the development of regenerative medicine approaches. Methods: A series of eight patients with PROM1-associated retinopathies was analyzed. Three patients with the same homozygous variant, c.1354dupT (p.Tyr452Leufs*13), were identified, each exhibiting a different autosomal recessive (AR) phenotype: Cone-Rod Dystrophy (CORD), Retinitis Pigmentosa (RP), and Stargardt Disease Type 4 (STGD4). These target patients, along with a healthy relative, underwent comprehensive ophthalmological examination and CES. Subsequently, iPSCs were generated from each target patient using episomal reprogramming and CRISPR/Cas9. These iPSCs were characterized according to international standards and genetically edited to correct the mutation. Restoration of PROM1 expression in the edited iPSC lines was confirmed by flow cytometry and Western blot (WB) analysis. Results: The target patients carried monoallelic variants in genes associated with the complement system, lipid metabolism, glaucoma, photoreceptor differentiation, and peroxisome biogenesis disorders. The following iPSC lines were generated: [CORD]-FiPSC1-Ep5F-2, [RP]-FiPSC1-Ep5F-10, and [STGD4]-FiPSC1-Ep5F-8, all of which met the required pluripotency and functionality characterization criteria. The edited iPSC lines: [CORD]-FiPSC1-Ep5F-2-GC1-23, [RP]-FiPSC1-Ep5F-10-GC1-18, and [STGD4]-FiPSC1-Ep5F-8-GC1-2 were generated and tested positive for CD133 in both flow cytometry and WB analyses. Conclusions: The homozygous PROM1 variant c.1354dupT (p.Tyr452Leufs*13) is associated with three distinct AR IRD phenotypes: CORD, RP, and STGD4. This pleiotropic effect may be influenced by monoallelic variants in modifier genes; however, further research is required to establish a causal relationship. The iPSC lines derived from the patients are pluripotent and functional; furthermore, the gene-editing machinery successfully restored the ability of PROM1 to encode CD133 in the edited iPSC lines. The generated iPSC lines can be used to model PROM1-associated retinopathies. In addition, after functional validation, the edited iPSC lines and the developed CRISPR/Cas9 system may serve as a foundation for the future development of gene and cell therapies for patients with PROM1-related retinopathies.

Introducción: Las distrofias hereditarias de la retina (IRD, del inglés Inherited Retinal Dystrophies) son una de las principales causas de ceguera irreversible a nivel mundial. Son causadas por mutaciones en genes que desencadenan la degeneración de los fotorreceptores y la pérdida progresiva de la visión. Las IRD afectan la calidad de vida de los pacientes y sus familias, generando un considerable impacto social y una constante presión sobre los recursos sanitarios debido a su naturaleza crónica y progresiva, sobre todo porque la gran mayoría carecen de tratamientos curativos. Asimismo, su enorme heterogeneidad fenotípica y genotípica, dificulta su diagnóstico y comprensión de su fisiopatología. Las IRD asociadas al gen PROM1 son una muestra representativa de esta heterogeneidad. En este escenario, la Secuenciación de Nueva Generación (NGS, del inglés Next Generation Sequencing) se ha vuelto una herramienta esencial para estudiar la heterogeneidad molecular de las IRD. Esta tecnología permite escoger la región genómica que se desea analizar y secuenciar millones de fragmentos de DNA; específicamente, el análisis del Exoma Clínico (CES, del inglés Clinical Exome Sequencing) analiza las regiones codificantes de genes relevantes para la patología del paciente, incrementando la posibilidad de encontrar genes modificantes. Por otro lado, las células madre pluripotentes inducidas (iPSC, del inglés induced Pluripotent Stem Cells) han supuesto una revolución en el estudio de la fisiopatología de las IRD mediante la generación de modelos in vitro basados en iPSC, especialmente cuando son combinadas con la tecnología de edición genética CRISPR/Cas9. Además, a nivel terapéutico, los derivados de iPSC sirven en el desarrollo de opciones terapéuticas en medicina regenerativa. Métodos: Se tomó una serie de 8 pacientes con IRD asociadas al gen PROM1. Se identificaron tres pacientes con la misma variante c.1354dupT (p.Tyr452Leufs*13) en homocigosis, que expresaban fenotipos autosómicos recesivos (AR) diferentes: Distrofia de conos-bastones (CORD, del inglés Cone-Rod Dystrophy), Retinitis pigmentosa (RP) y enfermedad de Stargardt tipo 4 (STGD4, del inglés Stargardt Disease Type 4). Estos pacientes objetivo, junto con un familiar sano, se sometieron a un examen oftalmológico completo y a un CES. Posteriormente, se generaron iPSC derivadas de cada paciente objetivo mediante reprogramación episomal utilizando CRISPR/Cas9. Estas iPSC se caracterizaron según estándares internacionales y se editaron genéticamente para corregir la mutación. La restauración del gen PROM1 en las líneas iPSC editadas se verificó mediante citometría de flujo y análisis por Western Blot (WB). Resultados: El estudio genético reveló que los pacientes objetivo presentaban variantes monoalélicas en genes asociados al sistema del complemento, metabolismo lipídico y glaucoma, a la diferenciación de fotorreceptores y a los trastornos de la biogénesis de peroxisomas. Además, se generaron las líneas iPSC [CORD]-FiPSC1-Ep5F-2, [RP]-FiPSC1-Ep5F-10, [STGD4]-FiPSC1-Ep5F-8, las cuales pasaron todas las pruebas de caracterización de pluripotencia y funcionalidad. Las líneas iPSC editadas [CORD]-FiPSC1-Ep5F-2-GC1-23, [RP]-FiPSC1-Ep5F-10-GC1-18, [STGD4]-FiPSC1-Ep5F-8-GC1-2 fueron positivas para CD133 en los análisis de citometría de flujo y WB. Conclusiones: La variante c.1354dupT (p.Tyr452Leufs*13) en homicigosis del gen PROM1, se asocia a tres fenotipos AR de IRD diferentes: CORD, RP y STGD4. Este efecto pleiotrópico podría estar relacionado con la influencia de variantes monoalélicas en genes modificantes; sin embargo, se requiere más investigación para establecer una relación de causalidad. Las líneas iPSC derivadas de los pacientes son pluripotentes y funcionales; asimismo, la maquinaria de edición genética diseñada restauró la capacidad del gen PROM1 para codificar CD133 en las líneas iPSC editadas. Las líneas iPSC generadas podrán usarse en el modelado de retinopatías asociadas a PROM1. Además, después de la caracterización funcional, las líneas de iPSC editadas y la maquinaria CRISPR/Cas9 desarrollada podrán servir como base para el desarrollo futuro de terapias génicas y celulares para pacientes con retinopatías asociadas al gen PROM1.