Métodos de modificación génica dirigida en células humanas y su aplicación en el Síndrome de Wiskott-Aldrich

Abstract

Generamos una línea celular reportera (RCL) en la que introdujimos una copia del gen EGFP truncado en 3´. También generamos un virus adenoasociado recombinante (rAAV), que contenía el gen EGFP truncado en 5´. Utilizando la RCL y el rAAV, junto con nucleasas TALEs, estudiamos una proteína de fusión y una librería de siRNAs para incrementar la frecuencia de recombinación homóloga (RH). Habiendo determinado las condiciones que generaron un mayor aumento en la frecuencia de RH, aplicamos estas para la generación de una línea celular KO para el gen WAS (Wiskott-Aldrich Syndrome) en fibroblastos. Para ello generamos un rAAV con una mutación en WAS. Posteriormente, se corrigió la mutación en dichas células, utilizando un rAAV con una copia wt del gen. Construimos también una línea WAS-KO en la línea celular Jurkat utilizando las nickasas CRISPR/Cas9. Los fibroblastos corregidos, que contienen una copia normal de WAS se transdiferenciaron a células CD45+.