Producción biotecnológica en Escherichia coli de la toxina PD-L4 de la planta Phytolacca dioica

Abstract

Las proteínas inactivadoras de ribosomas (RIPs) son toxinas ampliamente distribuidas en las plantas, bacterias y hongos capaces de inactivar irreversiblemente los ribosomas y detener la síntesis de proteínas. Las RIPs ejercen su efecto tóxico mediante su unión a la subunidad ribosómica 60S, donde actúan con actividad N-glicosilasa (EC.3.2.32.22), provocando la liberación específica de una adenina (A4324) del RNA ribosómico 28S, bloqueando de forma irreversible la traducción de proteínas, lo que finalmente conduce a la muerte celular. En las hojas de la planta Phytolacca dioica L. se han encontrado dos genes que codifican para la secuencia primaria de dos RIPs de tipo 1. Durante el proceso biosintético cada cadena polipeptídica sufre diferentes modificaciones post-traduccionales que dan lugar a cuatro proteínas distintas, dos de cada secuencia génica, denominadas PD-L1 y PD-L2, y PD-L3 y PD-L4, cada par de polipéptidos comparte la misma estructura primaria. Con el fin de utilizar estas proteínas con propiedades citotóxicas como posibles fármacos biológicos en la terapia del cáncer, el gen que codifica PD-L4 se expresó en la bacteria Escherichia coli utilizando el promotor de la RNA polimerasa T7. La proteína producida por la bacteria de este modo, se acumuló en los cuerpos de inclusión formando agregados insolubles. La actividad inactivadora de ribosomas del producto recombinante se regeneró mediante oxidación controlada de la proteína reducida y desnaturalizada durante el proceso de solubilización de los cuerpos de inclusión. La proteína recombinante obtenida en E. coli mediante este procedimiento, era indistinguible de la PD-L4 nativa aislada de las hojas de Phytolacca dioica, tanto en la actividad catalítica como en la estructura primaria y por lo tanto puede ser utilizada para la producción de inmunotoxinas activas.