Generación de líneas celulares humanas KNOCKOUT mediante el uso del sistema CRISPR/Cas9

Abstract

La terapia génica consiste en la introducción de material genético en la célula con el fin de sustituir o reparar un gen defectuoso. Existen tres formas de emplear dicha terapia: sustitución génica (que consiste en la sustitución del gen defectuoso por el gen normal mediante recombinación homóloga), inserción génica (es decir, introducción de una copia del gen funcional para compensar el defectivo, sin modificar dicho gen endógeno), o modificación génica (donde el gen defectuoso es reparado mediante mutagénesis dirigida). Esta terapia puede llevarse a cabo in vivo o ex vivo. Las terapias in vivo se basan en la administración directa del gen terapéutico al paciente. Frente a ellas, las terapias ex vivo cobran importancia al permitir el tratamiento de las células aisladas en cultivo, lo que ofrece la posibilidad de la manipulación in vitro con el transgén. El vehículo encargado de introducir el material genético deseado en el interior de la célula diana se denomina vector, el cual puede ser transferido mediante un método de transducción (vectores virales) o de transfección (mediante métodos químicos o físicos). Entre los métodos de transferencia génica basados en vectores no virales se encuentran los métodos químicos, como la lipofección y el empleo de fosfato cálcico o de DEAE-dextran; y los métodos físicos como la electroporación, la micro-inyección y la micro-balística. Por otro lado, los vectores virales, que provienen de virus modificados (recombinantes) como Retrovirus, Lentivirus, Adenovirus, Virus Adeno-asociados o Herpes Simplex Virus entre otros, son muy eficientes en la transferencia de material genético en las células hospedadoras y pueden dirigirse a las mismas de forma específica. Sin embargo, a excepción de los Adenovirus, Herpes Simplex Virus y Virus Adeno-asociados (cuya localización es extracromosómica), el resto presentan la desventaja de insertarse en el genoma del huésped al azar e incluso ser capaces de insertar varias copias. Estos inconvenientes pueden ser causa de mutagénesis y conducir a la muerte celular. Además, la estabilidad de la expresión del transgén es impredecible