Development of real-time PCR systems based on SYBR® Green I, Amplifluor™ and TaqMan® technologies for specific quantitative detection of the transgenic maize event GA21

Abstract

Descubrimos que GA21 tenía integrado varias copias repetidas en tándem del constructo que codifica una enzima 5-enolpiruvylshikimate-3-fosfato sintasa utilizado para la transformación de plantas. Hemos podido amplificar una secuencia de nucleótidos correspondiente al vector plasmídico utilizado en la transformación, flanqueado por el promotor r-act y el terminador 3′ de la nopalina sintasa que permite la detección y cuantificación específica del ADN de la línea de maíz transgénico Roundup Ready® GA21 mediante PCR convencional y en tiempo real. Se diseñaron cebadores y sonda TaqMan específicos para GA21 dirigidos a la región de unión vector-promotor y que amplifican un fragmento de ADN de 72 pb. Los métodos de cuantificación se optimizaron mediante tres químicas de PCR en tiempo real diferentes, SYBR® Green I, Amplifluor™ y TaqMan®. Los tres métodos demostraron ser específicos, altamente sensibles y fiables tanto para la identificación como para la cuantificación del ADN GA21. Una parte importante es la cuantificaicón porque la legislación en aquel momento permitía un 1% de contaminación accidental. Para ello se construyó un plásmido pGAivr que contenía copias únicas de los amplicones GA21 e invertasa para su uso como patrón externo en las curvas de calibración. Utilizando pGAivr, se optimizó un ensayo de PCR en tiempo real basado en TaqMan® en formato dúplex dirigido al gen ivr1 específico de la especie del maíz y a la región de unión GA21. El límite de detección del método fue del 0,01% de GA21, muy por debajo del umbral establecido para la presencia accidental de organismos modificados genéticamente (OMG), por lo que este método resultó adecuado para su uso en análisis rutinarios de OMG