Quantitative Detection of Clostridium perfringens by Real-Time PCR in Raw Milk

Abstract

Clostridium perfringens provoca un amplio espectro de enfermedades tanto en humanos como en animales y es una causa importante de enfermedades transmitidas por los alimentos. Hemos desarrollado y probado un ensayo de PCR (Q-)en tiempo real para la detección específica de C. perfringens que tiene como diana el gen de la fosfolipasa C (plc) e incluye un control interno de amplificación (IAC), lo que permite identificar los resultados falsos negativos, que son frecuentes debido al alto nivel de inhibición de la PCR por compuestos alimentarios. El ensayo de PCR en tiempo real (RTi-PCR) CPplc-IAC fue 100% selectivo, como se muestra con 36 cepas de Clostridium y 85 cepas no-Clostridium, con una sensibilidad analítica de 1 equivalente genómico (GE) en el 23% de las reacciones y de 10 GE en el 100% de las reacciones. La cuantificación fue lineal (R2 = 0,9990) en un rango dinámico de 7 log, hasta 10 GE, con una eficiencia de PCR E = 0,841. La aplicabilidad de este ensayo RTi-PCR se evaluó en muestras de leche. El ensayo detectó hasta 300 esporas en 25 mL de leche cruda de oveja contaminada artificialmente con un 78% de probabilidad y 30 esporas en 25 mL con un 50% de probabilidad. También tiene una precisión del 83,03 al 151,18%, como muestra una evaluación de la correspondencia entre los resultados del ensayo RTi-PCR y el número de esporas por mililitro determinado por chapado estándar. Este método RTi-PCR resultó eficaz para la detección y cuantificación de C. perfringens en la leche, teniendo una importante aplicabilidad en el control de este patógeno en la industria alimentaria láctea.