Generación de modelos celulares de enfermedad mitocondrial mediante la herramienta CRISPR/Cas9

Abstract

En este trabajo de fin de grado, se desarrolló un modelo celular para el estudio de enfermedades mitocondriales utilizando la herramienta de edición genética CRISPR/Cas9. El objetivo principal fue introducir la mutación 1660C>T asociada con el síndrome de Leigh (un trastorno neurodegenera tivo severo en el gen SDHA que forma parte del Complejo II mitocondrial . Para ello, se seleccionaron guías de RNA (gRNA) específicas, sintetizadas y purificadas mediante técnicas estándar. Las condiciones de electroporación fueron optimizadas en células U2OS utilizando el sistema de electroporación Neon, para luego aplicarlas en la línea celular 143 B. Se utilizó un oligo donante específico para introducir la mutación deseada. Tras la electroporación, se sembraron las células mediante dilución límite y se preparó DNA genómico para su análisis por PCR con objeto de identificar las células donde ha ocurrido edición génica. Falta por analizar mediante secuenciación “Sanger" si la edición ha ocurrido sin errores y si está en heterocigosis u homocigosis . Este modelo celular proporcionará una plataforma valiosa para estudiar los cambios metabólicos y funcionales causados por dicha mutación y abre la posibilidad de ensayar estrategias que recuperen las funciones celulares alteradas presentes en este síndrome . La creación de modelos celulares específicos para enfermedades genéticas permite una mejor comprensión de los procesos patológicos y ofrece oportunidades para desarrollar y ensayar terapias innovadoras.