Translational development of an antiviral treatment against respiratory RNA viruses based on CRISPR-CasRx technology

Abstract

Influenza viruses are a common cause of respiratory tract infections, causing epidemics each year. However, as historical events have demonstrated, they also carry the potential to cause global pandemics. The impact of these viruses on global health and its socioeconomic effects are significant. The best prophylactic strategy against it is vaccination, although the low percentage of vaccination in the population affects its effectiveness, which is also decreased due to sudden antigenic drifts in the viral glycoproteins. In severe cases of infection, the use of antiviral drugs is recommended, to lessen the symptoms and improve the prognosis of the disease. However, there is currently a lack of effective antiviral drugs, as all available options are susceptible to the development of resistances. For this reason, there is a need to develop new antivirals that are easily adaptable to specific mutations of epidemic viruses and that can be produced quickly and cheaply so that they can be adapted to the sudden appearance of mutations. These novel antivirals could also prove valuable in pandemic scenarios, given their potential for rapid design and production. The recent COVID-19 pandemic exemplifies the urgent need for such adaptable therapeutic strategies. Overall, there remains a pressing need to expand and improve the current arsenal of approved antivirals targeting respiratory viruses in the human population. In this study, we propose the CRISPR-CasRx system as a novel antiviral mechanism. Due to its programmability, CasRx can be readily adapted to target the genome sequences of emerging RNA viruses. Promising advances in delivery methods, particularly using adeno-associated viral vectors, further support its potential for therapeutic use. We evaluated multiple guide RNAs targeting the influenza virus hemagglutinin and neuraminidase, as well as the SARS-CoV-2 PLpro. Our results highlight the critical influence of guide RNA design on CasRx activity, emphasizing the importance of careful target sequence selection to achieve optimal RNA cleavage. Most of the guides tested resulted in statistically significant reductions in mRNA and protein levels of the target sequences. Although further antiviral assays are needed, our data demonstrate promising results in the reduction of the viral load in influenza in vitro models. And a clear reduction in both mRNA and protein expression in SARS-CoV-2 antiviral assays, supporting their potential as antiviral tools. Overall, the findings presented in this thesis highlight the potential of CRISPR-CasRx systems as a novel antiviral strategy against respiratory RNA viruses. While further studies are needed to confirm their impact on viral progeny and to optimize delivery systems, particularly for in vivo applications, these results lay important groundwork for the development of adaptable and effective RNA-targeting antiviral therapies.

Los virus de la gripe son una de las causas más comunes de infecciones del tracto respiratorio, provocando epidemias anuales. Sin embargo, también tienen potencial pandémico, como han demostrado históricamente. El impacto de estos virus en la salud global y sus efectos socioeconómicos son muy elevados. La mejor estrategia profiláctica contra estos virus es la vacunación, aunque actualmente hay un bajo índice de vacunación en la población, afectando a su efectividad, la cual también se ve disminuida debido a las múltiples mutaciones provocadas durante la replicación viral en las glicoproteínas de superficie del virus. En los casos más graves, se recomienda el uso de antivirales para disminuir los síntomas y mejorar el pronóstico de la enfermedad. Sin embargo, el arsenal antiviral contra los virus de la gripe es escaso dado que estos antivirales están expuestos al desarrollo continuo de resistencias. Por esta razón, es necesario desarrollar antivirales de nueva generación que sean fácilmente adaptables a las mutaciones de los virus epidémicos en circulación, y que puedan producirse de forma rápida y económica, para así poder responder ante la aparición repentina de nuevas mutaciones. Estos antivirales de nueva generación también podrían ser valiosos en escenarios pandémicos, dado su potencial diseño de rápida producción. La reciente pandemia de COVID-19 ejemplifica la necesidad urgente de contar con estrategias terapéuticas adaptables. En términos generales, continúa siendo necesaria la expansión y mejora de las terapias antivirales disponibles y aprobadas frente a virus respiratorios de ARN, con el fin de atender adecuadamente a la población. En este estudio, proponemos los sistemas CRISPR-CasRx como un nuevo mecanismo de acción antiviral. Debido a su programabilidad, las endonucleasas CasRx pueden adaptarse fácilmente para la ruptura específica de secuencias de RNA presentes en el genoma de virus emergentes de RNA. Además, los avances científicos para encontrar posibles métodos de administración de esta herramienta, como son los vectores de virus adenoasociados, respaldan aún más su potencial uso terapéutico. En este estudio hemos evaluado múltiples guías dirigidas contra la hemaglutinina y neuraminidasa de los virus de la gripe, y la PLpro de los virus SARS-CoV-2. Nuestros resultados destacan la importancia en el diseño de la guía de RNA para lograr eficacias óptimas en la ruptura provocada por las endonucleasas CasRx. La mayoría de las guías evaluadas resultaron en reducciones significativas en los niveles de RNA mensajero y proteína de las secuencias objetivo. Aunque se requieren más ensayos antivirales, nuestros datos muestran resultados esperanzadores en la reducción de la carga viral en modelos antivirales in vitro de gripe. Además, son capaces de reducir la expresión de ARN mensajero y proteína en ensayos antivirales de SARS-CoV-2, lo que respalda su potencial como herramientas antivirales. En conjunto, los hallazgos presentados en esta tesis destacan el potencial del sistema CRISPR-CasRx como una estrategia antiviral novedosa contra virus respiratorios de ARN. Si bien se necesitan más estudios para confirmar su impacto en la inhibición de la viabilidad de la progenie viral, y optimizar a su vez los sistemas de administración para las aplicaciones in vivo, estos resultados cimientan las bases para el desarrollo de nuevas terapias antivirales efectivas y adaptables.