Novel allogeneic CAR-T cell therapy targeting NKG2D ligands: universal immunotherapy against solid and haematological tumours

Abstract

Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T cell therapy has demonstrated impressive clinical outcomes, even in case of relapsed or refractory haematological malignancies. However, all currently commercialized therapies are autologous and target a single cancer-specific antigen. This approach entails some limitations, including high costs, manufacturing delays, and the risk of antigen-negative tumour relapses.

To address these challenges, a novel CAR-T cell therapy was developed for allogeneic use by combining CRISPR/Cas9 technology to eliminate the expression of T-cell receptor (TCR) and HLA class I complexes in healthy donor T cells, thereby reducing the risk of graft-versus-host disease and immune rejection, respectively, with lentiviral transduction to introduce an atypical CAR, NKG2D-CAR, which targets eight different ligands commonly upregulated in both solid and haematological tumours, theoretically being less prone to tumour resistance and relapse.

The novel CAR-T cell prototype was optimized through testing different interleukin (IL) culture supplementations (IL-2; IL-7/IL-15; IL-7/IL-15/IL-21) to promote an early memory T cell phenotype, which is associated with improved in vivo performance, identifying the IL-7/IL-15/IL-21 supplementation as the most effective combination.

In vitro assays demonstrated their strong antitumour efficacy against both solid tumours (cervicouterine and colorectal) and haematological malignancies (multiple myeloma), accompanied by high pro-inflammatory cytokine secretion. An alternative T cell source (bone marrow) was also assessed and found to be equally viable compared to buffy coat for CAR-T cell production.

Strategies to promote CAR-T cell expansion were evaluated, including activation of CAR signalling through soluble or overexpressed NKG2D ligands. To boost therapeutic potential, PD-1 knockout was performed to increase efficacy against solid tumours, while base editing technologies were applied to minimize off-target effects and enhance safety.

Finally, manufacturing process improvements, including time reduction and large-scale electroporation, were implemented to support scalable and efficient production.

In summary, this study presents the development of a novel, universal NKG2D CAR-T cell prototype for allogeneic use, representing a promising advancement in cancer immunotherapy.

La terapia de células T con receptores de antígenos quiméricos (CAR) ha demostrado unos resultados clínicos impresionantes, incluso en el caso de neoplasias hematológicas recidivantes o refractarias. Sin embargo, todas las terapias comercializadas actualmente son autólogas y se dirigen contra un único antígeno específico del cáncer. Este enfoque conlleva algunas limitaciones, como costes elevados, retrasos en la fabricación y riesgo de recaídas tumorales por pérdida de antígeno.

Para hacer frente a estos retos, se desarrolló una nueva terapia de células CAR-T para uso alogénico combinando la tecnología CRISPR/Cas9 para eliminar la expresión de los complejos receptor de células T (TCR) y HLA de clase I en las células T del donante sano, reduciendo así el riesgo de enfermedad de injerto contra huésped y de rechazo inmunitario, respectivamente, con la transducción lentiviral para introducir un CAR atípico, NKG2D-CAR, que reconoce ocho ligandos diferentes comúnmente sobre-expresados tanto en tumores sólidos como hematológicos, siendo teóricamente menos propenso a la resistencia tumoral y la recaída.

El nuevo prototipo de células CAR-T se optimizó suplementando el medio de cultivo con diferentes interleucinas (IL-2; IL-7/IL-15; IL-7/IL-15/IL-21) para promover un fenotipo de célula T con memoria temprana, que se asocia con un mejor rendimiento in vivo, identificando el suplemento con IL-7/IL-15/IL-21 como la combinación más eficaz.

Los ensayos in vitro demostraron su gran eficacia antitumoral contra tumores sólidos (cervicouterinos y colorrectales) y hematológicos (mieloma múltiple), acompañada de una elevada secreción de citoquinas proinflamatorias. También se evaluó una fuente alternativa de células T (médula ósea) y se comprobó que era igual de útil que el buffy coat para la producción de células CAR-T.

Se evaluaron estrategias para promover la expansión de células CAR-T, incluida la activación de la señalización a través del CAR mediante ligandos de NKG2D solubles o sobre-expresados. Para aumentar el potencial terapéutico, se realizó la eliminación del receptor PD-1 con el fin de aumentar la eficacia contra tumores sólidos, mientras que la tecnología de edición de bases se aplicó para minimizar los efectos fuera del objetivo y mejorar la seguridad.

Por último, se introdujeron mejoras en el proceso de fabricación, como la reducción del tiempo y la electroporación a gran escala, para lograr una producción escalable y eficiente.

En resumen, este estudio presenta el desarrollo de un novedoso prototipo de células CAR-T NKG2D universales para uso alogénico, que representa un avance prometedor en la inmunoterapia contra el cáncer.