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Título
Lipid Rafts in brain cells: From enzymatic activity to lipidomic assays in a novel printed Rafts platform
Autor
Director o Tutor
Año del Documento
2023
Titulación
Doctorado en Investigación Biomédica
Resumen
Changes in cellular homeostasis, such as oxidative stress, can trigger neurodegeneration, producing cellular pathological changes such as lipid peroxidation, oxidative modification of proteins, and DNA damage. Reactive Oxygen Species (ROS), key deregulators of cellular stability, can be produced by different oxidoreductase enzymes and by the mitochondrial electron transport chain (mETC). Many of these enzymes are located in liquid-ordered membrane domains, so-called lipid rafts, dynamic platforms that participate in various signaling pathways. Moreover, changes in the lipidic environment of membrane proteins can lead to important functional disruptions.
Lipidomic and enzymatic activity assays have been successfully performed in printed cell membrane homogenates (cell membrane microarrays, CMMAs). Based on that technology and the importance of liquid-ordered subdomains, we have developed a printed lipid raft and non-raft platform (raft membranes microarrays, RMMAs), with preserved native protein structure and lipidic environment.
To evaluate the differences over lipidic environment in raft and non-raft subdomains in control, metabolic and oxidative stress conditions MALDI-MS assay was performed on RMMAs. Raft and non-raft subdomains presented a distinguishable fingerprint in every condition in both cell types (astrocytes and neurons). Distinguishable lipid fingerprints were also observed comparing raft subdomains obtained from cells in control, metabolic and oxidative stress situations. In the same way, raft and non-raft domains from control astrocytes and neurons are also distinguishable. Therefore, the lipidomic data obtained with this methodology can be used as a classification tool for samples of raft and non-raft subdomains with different treatments.
As the lipidic environment is a key aspect for proper physiological enzymatic activity, changes over lipidome can lead to differences between enzymatic activities. To evaluate the differences in enzymatic activities inside the raft domains between stressed and non-stressed astrocytes, NADH oxidoreductase, GADPH, and Cholinesterase activity assays were performed on RMMAs. Higher NADH oxidoreductase activity in raft domains from metabolically stressed astrocytes was observed, whereas no differences were observed in GAPDH and Acetylcholinesterase activities. By contrast, rafts from neuronal samples presented high activity of both GAPDH and Acetylcholinesterase. Furthermore, NADH and GAPDH activities revealed a positive correlation between them and specific phospholipids, but surprisingly not with sphingolipids, one of the main components of lipid rafts. Thus, these data show the close relationship between lipidic structure in liquid-ordered domains and enzymatic activities.
The results presented in this Ph.D. Thesis reveal the importance of a proper lipidic environment in lipid raft domains, and the impact over enzymatic activities, in two major cell types of the nervous system. This Thesis demonstrates the suitability of this newly-developed technology to make high-throughput analysis of lipid environment-function relationships in printed RMMAs of neuronal and astrocyte membranes. Los cambios en la homeostasis celular, como el estrés oxidativo, pueden desencadenar procesos neurodegenerativos, produciendo cambios patológicos celulares como la peroxidación lipídica, la modificación oxidativa de las proteínas y daños en el ADN. Las especies reactivas de oxígeno (ROS), los cuales son desreguladores clave de la estabilidad celular, pueden ser producidas por diferentes enzimas oxidorreductasas y por la cadena de transporte de electrones mitocondrial (mETC). Muchas de estas enzimas se localizan en subdominios de membrana "ordenados", las llamadas balsas lipídicas (Raft), las cuales son plataformas dinámicas que participan en diversas vías de señalización. Además, los cambios en el entorno lipídico de las proteínas de membrana pueden provocar importantes alteraciones funcionales.
Se han realizado con éxito ensayos lipidómicos y de actividad enzimática en homogeneizados impresos de membranas celulares (microarrays de membranas celulares, CMMA). Basándonos en esa tecnología y en la importancia de los subdominios ordenados en líquido, hemos desarrollado una plataforma impresa de muestras de membrana procedentes de membrana plasmática al uso y balsas lipídicas (Microarrays de membranas Raft, RMMAs), con estructura proteica nativa y entorno lipídico preservado.
Para evaluar las diferencias sobre el entorno lipídico en los subdominios Raft y en las membranas no-Raft en condiciones de control, y de estrés metabólico y oxidativo, se realizó un ensayo MALDI-MS en las RMMAs. Estos subdominios presentaron una huella lipidica distinguible en cada condición en ambos tipos celulares (astrocitos y neuronas). También se observaron huellas lipídicas distinguibles comparando subdominios Raft obtenidos de células en situaciones de control, metabólicas y de estrés oxidativo. Del mismo modo, también son distinguibles los dominios Raft y no Raft procedentes de astrocitos y neuronas control. Por tanto, los datos lipidómicos obtenidos con esta metodología pueden utilizarse como herramienta de clasificación de muestras de subdominios Raft y no Raft con diferentes tratamientos.
Dado que el entorno lipídico es un aspecto clave para la correcta actividad enzimática fisiológica, los cambios sobre el lipidoma pueden dar lugar a diferencias entre las actividades enzimáticas. Para evaluar las diferencias en las actividades enzimáticas dentro de los dominios de la balsa entre astrocitos estresados y no estresados, se realizaron ensayos de actividad de NADH oxidorreductasa, GADPH y colinesterasa en RMMAs. Se observó una mayor actividad de la NADH oxidorreductasa en los dominios de balsa de los astrocitos sometidos a estrés metabólico, mientras que no se observaron diferencias en las actividades de la GAPDH y la acetilcolinesterasa. Por el contrario, las balsas procedentes de muestras neuronales presentaron una actividad elevada tanto de GAPDH como de Acetilcolinesterasa. Además, las actividades de NADH y GAPDH revelaron una correlación positiva entre ellas y fosfolípidos específicos, pero sorprendentemente no con los esfingolípidos, uno de los principales componentes de las balsas lipídicas. Así pues, estos datos muestran la estrecha relación existente entre la estructura lipídica en dominios lipídicos ordenados y las actividades enzimáticas.
Los resultados presentados en esta Tesis Doctoral revelan la importancia de un entorno lipídico adecuado en dominios de balsa lipídica, y el impacto sobre las actividades enzimáticas, en dos tipos celulares principales del sistema nervioso. Esta Tesis demuestra la idoneidad de esta tecnología para realizar análisis de alto rendimiento de las relaciones entorno lipídico-función en RMMA impresos de membranas neuronales y de astrocitos.
Materias (normalizadas)
Biología molecular
Materias Unesco
2302 Bioquímica
Palabras Clave
Lipid Raft
Balsas lipídicas
Cell Membrane Microarrays
Microarrays de membrana
Lipidomic analysis
Lipidómica
Departamento
Escuela de Doctorado
Idioma
eng
Tipo de versión
info:eu-repo/semantics/publishedVersion
Derechos
openAccess
Aparece en las colecciones
- Tesis doctorales UVa [2292]
Ficheros en el ítem
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