Metabolic rewiring is required for inflammation, calcification, and osteogenic differentiation of human aortic valve interstitial cells exposed to an inflammatory milieu, and mimics the metabolic phenotype in calcified aortic valves

Abstract

Introduction and objectives: Inflammation has been linked to metabolic reprogramming in several diseases, including cardiovascular pathogenesis. Calcific aortic valve disease (CAVD) is an increasingly prevalent valvulopathy, yet surgical replacement is the only available therapy. CAVD is characterized by a damaged endothelium, inflammation, exaggerated matrix remodeling, calcification, and metabolic changes. At the cellular level, recent evidence disclose the interplay between innate immunity/inflammatory pathways, i.e., Toll-like receptors (TLR)3/4 and interferon-γ receptor signaling, on the differentiation, calcification, and inflammation of valve interstitial cells (VIC) via stabilization of hypoxia-inducible factor (HIF)-1α. Given that this transcription factor is associated with metabolic reprogramming in several diseases, inflammation and metabolism may work in an interconnected manner in CAVD. Therefore, the main goal of this study was to investigate the metabolic reprogramming of VIC under inflammatory settings, and its contribution to the processes relevant to CAVD pathogenesis. Material and methods: Human VIC from patients with no valve disease were used as a model. To mimic an inflammatory environment, cells were treated with pro-inflammatory cytokines and pathogen patterns recognized by TLRs. Metabolic analysis was performed by real-time metabolic analysis using Seahorse extracellular flux assays, and [U-13C]-glucose tracing, by liquid chromatography/mass spectrometry. Metabolic gene profiles and metabolite production were evaluated by qPCR, Western blot, and commercial kits. Inflammation, calcification, and apoptosis were studied using Western blot, ELISA, qPCR, immunofluorescence, flow cytometry, gene silencing, and in vitro calcification assays. Validation of findings in human VIC was performed in quiescent VIC dedifferentiated from human VIC, in porcine 3D VIC-valve endothelial cell co-cultures, as well in valve leaflets and VIC explanted from patients with/without CAVD. Results: The main finding of the study is that inflammatory stimuli drive a metabolic reprogramming of VIC to a hyperglycolytic phenotype that mimics the metabolic phenotype in calcified valves. It is characterized by enhanced glycolysis and glycolytic ATP production, impaired pentose phosphate pathway (PPP), as well as damaged mitochondrial function with uncoupling of electron transport chain (ETC) and oxidative phosphorylation (OXPHOS). Furthermore, metabolic dysregulation is associated with reactive oxygen species (ROS) production, as well as increased reliance on glucose uptake for energy production and metabolite accumulation. Pharmacological approaches to metabolic routes demonstrate the role of glycolysis upregulation in processes relevant to CAVD, such as VIC differentiation, calcification, and inflammation, and have further highlight the contribution of PPP and oxidative stress in these processes. Our findings further reveal the involvement of the Janus kinase (JAK)-STAT/HIF-1α and nuclear factor (NF)-kB pathways in the metabolic reprogramming. Finally, the shift in VIC, also found in 3D VIC-VEC co-cultures exposed to inflammatory stimuli, replicates the hyperglycolytic profile of calcified cells and valve leaflets. Conclusion: Inflammation drives a metabolic shift in human VIC, mirroring the glycolytic phenotype in calcified valves, which is characterized by hyperglycolysis that is necessary to support inflammation, calcification, and osteogenic differentiation of VIC. Additional reprogramming of complementary catabolic pathways, such as PPP, tricarboxylic acid cycle, and oxidative phosphorylation, generates redox homeostasis alterations that further contribute to pathological processes in VIC. Thus, inflammation-triggered changes in metabolic phenotypes may play a relevant pathogenic role in the early stages of CAVD, and the identified metabolic routes may provide therapeutic clues for the disease.

Introducción y objetivos: La inflamación se ha relacionado con la reprogramación metabólica en varias enfermedades, incluyendo en el ámbito cardiovascular. La estenosis aórtica calcificada (CAVD) es una valvulopatía cada vez más prevalente, sin embargo, la sustitución quirúrgica es la única terapia disponible. La CAVD se caracteriza por el daño endotelial, una respuesta inflamatoria desregulada, la remodelación exagerada de la matriz extracelular, la calcificación y los cambios metabólicos. A nivel celular, estudios recientes han puesto de manifiesto la interacción entre la inmunidad innata y las vías inflamatorias, específicamente los receptores tipo Toll (TLR) 3/4 y la señalización del receptor de interferón-γ, en procesos de inflamación, calcificación y diferenciación de las células intersticiales de la válvula (VIC) a través de la estabilización del factor de transcripción dependiente de hipoxia (HIF)-1α. Dado que HIF-1α se ha asociado con la reprogramación metabólica en varias enfermedades, estas evidencias sugieren que la inflamación y el metabolismo pueden trabajar de manera interconectada en CAVD. Teniendo esto en cuenta, el objetivo principal de este estudio fue investigar la reprogramación metabólica de las VIC en entornos inflamatorios y su contribución a procesos relevantes en la patogénesis de CAVD. Material y métodos: Se utilizaron VIC humanas de pacientes control para generar el modelo de la enfermedad. Para generar un entorno inflamatorio, las células se trataron con citoquinas proinflamatorias y patrones asociados a patógenos reconocidos por los TLRs. Para el análisis del metabolismo celular se utilizó el analizador metabólico en tiempo real Seahorse además de experimentos fluxómica y trazado de [U-13C]-glucosa mediante cromatografía líquida/espectrometría de masas. Los perfiles de genes metabólicos y los metabolitos se evaluaron mediante qPCR, Western blot y kits comerciales. La inflamación, calcificación y apoptosis se estudiaron utilizando Western blot, ELISA, qPCR, inmunofluorescencia, citometría de flujo y ensayos de calcificación in vitro. Para la validación de los resultados obtenidos en VIC humanas, se utilizaron técnicas de desdiferenciación de células VIC a células con fenotipo quiescente y de co-cultivos de VIC-VEC en 3D. Además, los resultados también se validaron en válvulas y VIC explantadas de pacientes con o sin CAVD. Resultados: El hallazgo principal es la reprogramación metabólica de las VIC hacia un fenotipo hiperglucolítico inducido por agentes inflamatorios. Se caracteriza por el aumento de la glucólisis y la producción de ATP glucolítico, la alteración de la ruta de la pentosa fosfato (PPP), así como el daño en la función mitocondrial con desacoplamiento de la cadena de transporte de electrones (ETC) y la fosforilación oxidativa (OXPHOS). Además, la desregulación metabólica está relacionada con la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y con una mayor dependencia de la captación de glucosa para la producción de factores de energía y la acumulación de metabolitos. Aproximaciones farmacológicas de rutas metabólicas, demostraron el papel de la sobrerregulación de la glucólisis y de la producción de ROS, así como la desregulación de PPP en procesos relevantes para CAVD, como inflamación, calcificación y diferenciación de las VIC. Nuestros hallazgos también revelaron el papel de la PKM2 y de las vías del factor nuclear (NF)-κB y Janus kinase (JAK)-STAT/HIF-1α en la reprogramación metabólica. Finalmente, el cambio metabólico caracterizado en VIC, también se encontró en los co-cultivos 3D expuestos a estímulos inflamatorios y replica el perfil hiperglucolítico de las células y válvulas de pacientes con CAVD. Conclusión: El ambiente inflamatorio induce una reprogramación metabólica de VIC, que refleja el fenotipo glucolítico de las válvulas estenóticas. Esta reprogramación se caracteriza por el aumento de la glucólisis, necesario para mediar la inflamación, la calcificación y la diferenciación osteogénica de las VIC. La reprogramación adicional de vías catabólicas complementarias, como la vía de las pentosas fosfato, el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y la fosforilación oxidativa, genera alteraciones en la homeostasis redox que también contribuyen a los procesos patológicos en VIC. Por lo tanto, las alteraciones metabólicas desencadenadas por un ambiente inflamatorio podrían desempeñar un papel patogénico relevante en las etapas tempranas de CAVD, y las rutas metabólicas identificadas pueden ser potenciales dianas terapéuticas para la enfermedad.