Effect of the gluten-free diet on the intestinal and circulating immunome from patients with coeliac disease

Abstract

Introduction: Coeliac disease (CD) is an autoimmune disorder triggered by gluten ingestion in genetically predisposed individuals, primarily affecting the small intestine but with systemic implications. It leads to villous atrophy in the duodenum and involves intraepithelial lymphocytes (IEL) and lamina propria lymphocytes (LPL). CD is also linked to increased susceptibility to other autoimmune diseases and malignancies. A gluten-free diet (GFD) is the primary treatment, but adherence is challenging. Monitoring includes serological tests and detection of gluten immunogenic peptides in faeces. Hypothesis and Aim: It is hypothesized that persistent mucosal atrophy in CD patients, despite a GFD, may be linked to immune alterations in the mucosal and/or peripheral immune system. The aim of this thesis is to study the effect of a GFD on the phenotype and function of immune cells from the intestinal mucosa and peripheral blood in CD patients Material and Methods: The study characterized IEL throughout the human gastrointestinal tract (stomach, duodenum, ileum, and colon) and assessed their enrichment and cell culture. The effect of a GFD on the immunome was analyzed in duodenal LPL and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from non-celiac controls, newly diagnosed CD patients, and GFD-treated patients, categorized by symptom presence and villous atrophy was performed using top-of-the-art spectral and computational cytometry. Cytokines in the duodenal microenvironment and plasma samples were also evaluated Results: Significant immune shifts were observed in the gut, with Tγδ IEL expanding and classical T IEL decreasing, particularly in those with mucosal atrophy. Unexpectedly, IL-15R subunits were not significantly increased in IEL, but IL-15Rα expression was elevated in epithelial cells, suggesting a trans-presentation model where IL-15 is transferred from epithelial cells to IEL. NKG2D, an immune activation marker, was upregulated on T IEL, especially in patients with atrophy, suggesting its potential as an immune therapy target. Despite improvements in mucosal structure with GFD, persistent atrophy was observed in 68.4% of patients. Prolonged GFD use was linked to increased gut-homing markers (Integrins α4, β7, CCR9, CCR2) and inflammatory markers (CD2, CD38) in LPL. Symptomatic GFD-treated patients exhibited higher gut-homing markers in CD8 T cells and memory B cells, with reduced CXCR3 and CD38 expression in regulatory T cells. Cytokine analysis showed normalization of IL-18 and IL-12p70. Peripheral immune activation remained in newly diagnosed and GFD-treated patients with atrophy, indicating enhanced migration of immune cells to the intestine, contributing to ongoing mucosal damage. Discussion: Despite strict adherence to the GFD, many patients continue to exhibit villous atrophy and immune activation, suggesting unresolved chronic inflammation. This inflammation may be driven by factors such as dysbiosis or exposure to non-gluten dietary antigens, calling for a more comprehensive approach to treatment. The findings raise the question of whether persistent villous atrophy should be considered a marker of prolonged damage rather than a definitive sign of refractory coeliac disease (RCD). Personalized therapeutic strategies focusing on immune regulation, beyond gluten exclusion, are essential for better management of CD and improved long-term outcomes. Conclusions: Over half of CD patients show persistent villous atrophy despite GFD adherence. NKG2D expression on IEL is linked to atrophy, suggesting it as a target for immune therapies. IL-15 receptor expression is not increased in these lymphocytes, indicating other cytokines may play a role in their cytotoxicity. While the GFD restores immune balance in LPL, symptomatic patients exhibit increased gut-homing and inflammatory markers, which worsen over time. Atrophy and persistent symptoms correlate with peripheral immune activation, with increased inflammatory markers indicating unresolved chronic inflammation, potentially driven by dysbiosis or non-gluten dietary antigens.

Introducción: La enfermedad celíaca (EC) es un trastorno autoinmune desencadenado por la ingesta de gluten en individuos genéticamente predispuestos. Afecta principalmente al intestino delgado, aunque puede tener implicaciones sistémicas. Provoca atrofia vellositaria duodenal e involucra a los linfocitos intraepiteliales (LIE) y de la lámina propia (LLP). Además, se asocia con una mayor susceptibilidad a enfermedades autoinmunes y ciertos tipos de cáncer. El tratamiento principal es una dieta sin gluten (DSG), cuya adherencia es compleja. El seguimiento incluye pruebas serológicas y detección de péptidos inmunogénicos del gluten en heces. Hipótesis y objetivo: Se plantea que la persistencia de a pesar de seguir una DSG, podría relacionarse con alteraciones inmunológicas. El objetivo de esta tesis es estudiar el efecto de la DSG sobre el fenotipo y la función de células inmunitarias de la mucosa intestinal y sangre periférica en pacientes con EC. Material y métodos: Se caracterizaron LIE a lo largo del tracto gastrointestinal humano (estómago, duodeno, íleon y colon) y se evaluó su enriquecimiento y cultivo celular. Se analizó el efecto de la DSG sobre el inmunoma en LLP duodenales y células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de controles no celíacos, pacientes con EC recién diagnosticada y pacientes en DSG, categorizados según la presencia de síntomas y atrofia vellositaria. El análisis se realizó mediante citometría espectral y computacional. También se evaluaron citocinas en el microambiente duodenal y en muestras de plasma. Resultados: Se observó una expansión de LIE Tγδ y disminución de T clásicos, particularmente en aquellos con atrofia. Sorprendentemente, las subunidades del receptor de IL-15 no estaban aumentadas en los LIE, pero la expresión de IL-15Rα se elevó en células epiteliales, lo que sugiere un modelo de transpresentación. NKG2D, marcador de activación inmunitaria, se encontró sobreexpresado en LIE T, especialmente en pacientes con atrofia, indicando su potencial como diana terapéutica. Además, se observó atrofia persistente en el 68,4% de los pacientes. El uso prolongado de DSG se asoció con un aumento de marcadores de migración intestinal e inflamación en LLP. Los pacientes sintomáticos presentaron mayores niveles de marcadores de migración intestinal en células T CD8 y células B de memoria, junto con una menor expresión de CXCR3 y CD38 en células T reguladoras. El análisis de citocinas mostró normalización tras la DSG. La activación inmunitaria periférica persistió en pacientes con atrofia, lo que indica mayor migración de células inmunes al intestino y sugiere daño mucoso continuo. Discusión: Pese a la adherencia a la DSG, muchos pacientes continúan presentando atrofia y activación inmunitaria, sugiriendo una inflamación crónica no resuelta. Esta inflamación podría deberse a factores como disbiosis o exposición a otros antígenos dietéticos. Los hallazgos plantean la cuestión de si la atrofia vellositaria persistente debe considerarse un marcador de daño prolongado más que una señal definitiva de EC refractaria. Son esenciales estrategias terapéuticas personalizadas enfocadas en la regulación inmunitaria, más allá del gluten. Conclusiones: Más de la mitad de los pacientes con EC presentan atrofia persistente a pesar de cumplir con la DSG. Además, la expresión de NKG2D en LIE se asocia con esta atrofia, sugiriendo su potencial como diana terapéutica. La expresión del receptor de IL-15 no se encuentra aumentada en los LIE, indicando que otras citocinas podrían estar involucradas en su citotoxicidad. Aunque la DSG restaura el equilibrio inmunológico en LLP, los pacientes sintomáticos presentan aumentados los marcadores de migración intestinal e inflamación, agravándose con el tiempo. La atrofia y los síntomas se correlacionan con activación inmunitaria periférica, acompañada de marcadores inflamatorios elevados, lo que indica una inflamación crónica no resuelta, posiblemente impulsada por disbiosis o antígenos dietéticos no relacionados con el gluten.