Characterization of endogenous Kv1.3 channel isoforms in T cells.

Abstract

The voltage-gated potassium channel Kv1.3 plays a crucial role in T-cell activation and is considered a promising target for the treatment of autoimmune diseases. However, the lack of reliable antibodies has prevented its accurate detection and study under endogenous conditions, so that most published studies have been conducted in heterologous systems. To address this limitation, we engineered a Jurkat T-cell line expressing endogenous Kv1.3 channels tagged with a signal peptide to investigate the expression and localization of native Kv1.3 channels, and their role associated to T cell physiological responses. Using the CRISPR-Cas9 tool, we inserted a Flag-Myc peptide at the C terminus of the KCNA3 gene. Basal and activated channel expression were assessed through western blot analysis and imaging techniques. Surprisingly, besides the canonical Kv1.3 channel (54 KDa), we identified two additional isoforms with distinct N termini: a longer isoform (70 KDa) and a truncated isoform (43 KDa). All three isoforms showed upregulation after T-cell activation. Our focus was on characterizing the truncated isoform (short form, SF) as it had not been previously described and could be present in available Kv1.3-/- mouse models. Overexpressing SF in HEK cells generated Kv1.3-like currents with smaller amplitudes, which, unlike canonical Kv1.3, did not induce HEK proliferation. To explore the role of endogenous SF isoform in a native system, we generated both a knockout Jurkat clone and a clone expressing only the SF isoform. While the canonical isoform localized primarily at the plasma membrane, SF remained intracellular, accumulating perinuclearly. Consequently, SF Jurkat cells lacked Kv1.3 currents, exhibited depolarized resting membrane potential (EM), reduced Ca2+ influx, and diminished increases in intracellular calcium ([Ca2+]i) upon stimulation. Functional characterization of these Kv1.3 channel isoforms revealed their differential contributions to signaling pathways involved in immunological synapse formation. In conclusion, alternative translation initiation generates at least three endogenous Kv1.3 channel isoforms in T cells with distinct functional roles. Importantly, some of these functions do not require the formation of functional plasma membrane channels by Kv1.3 proteins.

El canal de potasio dependiente de voltaje Kv1.3 juega un papel crucial en la activación de las células T y se considera una buena diana terapéutica para el tratamiento de enfermedades autoinmunes. Sin embargo, la falta de anticuerpos específicos de la proteína ha impedido su detección y estudio precisos en condiciones endógenas, por lo que la mayoría de los estudios publicados se han realizado en sistemas heterólogos. Para abordar esta limitación, diseñamos una línea de células T Jurkat que expresa canales Kv1.3 endógenos marcados con un péptido señal para estudiar su expresión y localización además de su papel fisiológico en los linfocitos T. Usando la herramienta CRISPR-Cas9, insertamos un péptido Flag-Myc en el extremo C del gen KCNA3. La expresión del canal basal y activado se evaluó mediante análisis de transferencia Western y técnicas de imagen. Sorprendentemente, además del canal canónico Kv1.3 (54 KDa), identificamos dos isoformas adicionales con extremos N distintos: una isoforma más larga (70 KDa) y una isoforma truncada (43 KDa). Las tres isoformas mostraron un aumento de su expresión después de la activación de las células T. Nuestro objetivo fue caracterizar la isoforma truncada (forma abreviada, SF) ya que no se había descrito previamente y podría estar presente en los modelos de ratón Kv1.3-/- disponibles. La sobreexpresión de SF en células HEK generó corrientes similares a Kv1.3 con amplitudes más pequeñas que, a diferencia del Kv1.3 canónico, no indujeron la proliferación de HEK. Para explorar el papel de la isoforma SF endógena en un sistema nativo, generamos un clon de Jurkat knockout y un clon que expresa solo la isoforma SF. Mientras que la isoforma canónica se localizó principalmente en la membrana plasmática, el SF permaneció intracelular, acumulándose perinuclearmente. En consecuencia, las células SF Jurkat carecían de las corrientes Kv1.3, presentaban un potencial de membrana en reposo (EM) despolarizado, una entrada de Ca2+ reducida y un aumento disminuido del calcio intracelular ([Ca2+]i) tras la estimulación. La caracterización funcional de estas isoformas del canal Kv1.3 reveló sus contribuciones diferenciales a las vías de señalización involucradas en la formación de sinapsis inmunológicas. En conclusión, el inicio de la traducción alternativa genera al menos tres isoformas endógenas del canal Kv1.3 en las células T con distintas funciones funcionales. Es importante destacar que algunas de estas funciones no requieren la formación de canales de membrana plasmática funcionales por las proteínas Kv1.3.