Viabilidad de células estresadas de Cronobacter sakazakii mediante citometría de flujo y espectrometría de masas

Abstract

C. sakazakii is a thermotolerant pathogen associated with outbreaks in infants fed with reconstituted powdered infant formulae. These products are not stored under sterile conditions, so their contamination followed by improper preparation and storage can lead to bacterial growth. To limit the risk of C. sakazakii infection, reconstitution with water at 70°C is recommended. Although C. sakazakii infection has a moderate incidence, lethality and morbidity are high, with neurological sequelae occurring in many cases. The aim of the present study is to gain insight into the physiological states of C. sakazakii cells using flow cytometry to detect the compromised cells, which are viable but non-culturable using plate-based methods, and to evaluate the impact of milk heat treatments on those populations. Dead-cell suspensions as well as heat-treated and non-heat-treated cell suspensions were used. After 60 or 65 ◦C treatments, the number of compromised cells increased as a result of an increase in cells with damaged membranes, although they were not effective in inactivating the bacteria. Thus, mild heat treatments are not enough to guarantee the safety of reconstituted powdered infant formulae. Flow cytometry allowed the identification of C. sakazakii compromised cells that cannot be detected by classical plate count methods; hence, it could be used for screening studies in order to reduce the risk derived from the presence of pathogenic viable but non-culturable cells in food intended for newborn nutrition. In a second studio, dead cells were double-stained with SYTO 9- or SYBR Green I-PI. Cells were treated at different temperatures. Compromised cells were the most abundant at 60 and 65 ºC, but at 70 ºC onwards the most detected cells were dead cells. Over 80 ºC, all events were located in the dead cells area. Moreover, assays with different volumes of each dye solution were carried out at 70 ºC: from 0.125 to 1.5 µL. The populations showed statistically significant differences when comparing SYTO 9 and SYBR Green I staining. The maximum volume used is not necessary to detect live cells, but it is for detecting compromised or dead cells. Followed 2 h refrigeration at 4 ºC, sorted compromised cells showed no change in its detection. C. sakazakii cells from cross-contamination or poorly prepared infant formulae could recover and proliferate if there is a delay in consumption of more than 2 h at room temperature, constituting a public health risk. Finally, in a third work, the response of C. sakazakii to heat stress was studied by mass spectrometry. The expression of stress-related proteins and the peptide profile were analysed, with the aim of identifying biomarkers involved in the survival of the microorganism under sublethal environmental conditions. Four peptide markers were identified in the mass spectra corresponding to intact proteins. A potential stress biomarker of C. sakazakii was identified and validated at m/z 3336.6. The results showed that heat shock applied to the microorganism increased the expression of chaperones such as DnaK, ATP-independent proteins involved in proper folding and some virulence factors associated with the preservation of membrane integrity. These proteins seem to play a relevant role in the maintenance of protein synthesis as an adaptive mechanism to sublethal heat stress. The study of the resistance of C. sakazakii to sublethal temperature variations provides information on its viability and survival strategies, such as the generation of adaptive physiological states or the overexpression of peptide markers that may represent an additional pathogenicity pathway.

C. sakazakii es una bacteria patógena termotolerante asociada a brotes en recién nacidos alimentados con leche de fórmula infantil en polvo. Estas leches no se almacenan en condiciones estériles, por lo que la contaminación de estos productos sumado a una incorrecta preparación y almacenaje de los mismos puede conducir a la proliferación bacteriana. En un primer trabajo, se abordó el estudio de los estados fisiológicos de las células de C. sakazakii utilizando citometría de flujo con el fin de detectar las células comprometidas, que son aquellas viables pero no cultivables por los métodos de siembra en placa, así como evaluar el impacto de los tratamientos térmicos, habitualmente usados en la preparación de dichas leches, en esas poblaciones. Para ello, se utilizaron suspensiones de bacterias tratadas térmicamente, sin tratar y muertas. Tras tratamientos térmicos a 60 o 65ºC, el número de células comprometidas aumentó como resultado del incremento de células con membranas dañadas, aunque no resultaron efectivas para inactivar la bacteria. De esta forma, se evidencia que los tratamientos térmicos que no llegan a la pasteurización no son suficientes para garantizar la inocuidad de las leches reconstituidas. La citometría de flujo podría ser utilizada para realizar estudios de cribaje con el fin de disminuir el riesgo derivado de la presencia del microorganismo viable pero no cultivable en las leches de fórmula. En un segundo estudio, las células muertas de C. sakazakii se tiñeron doblemente con SYTO9- o con SYBR Green I-PI para determinar su estatus fisiológico a diferentes temperaturas utilizando citometría de flujo. Mientras que las células comprometidas fueron las predominantes a 60 y 65ºC, a 70ºC imperaron las muertas. A temperaturas mayores de 80°C, todos los eventos adquiridos se observaron en la zona de las células muertas. Se realizaron ensayos con distintos volúmenes de cada fluorocromo a 70ºC, desde 0,125 a 1,5 µl, encontrando diferencias estadísticamente significativas entre las tinciones con SYTO9 o con SYBR Green I. Los resultados muestran que el máximo volumen utilizado no es necesario para detectar las células vivas, pero sí lo es para las dañadas completa o parcialmente. La localización de las células comprometidas fue confirmada por separación celular, no detectando cambios en su estatus fisiológico tras un período de refrigeración de 2 h a 4ºC. Las células de C. sakazakii procedentes de una contaminación cruzada o de leches infantiles mal preparadas podrían recuperarse y multiplicarse si hay una demora en su consumo superior a 2 h a temperatura ambiente, constituyendo un riesgo de salud pública. En un tercer trabajo se estudió la respuesta de C. sakazakii al estrés térmico a través de espectrometría de masas basándonos en la expresión de proteínas relacionadas con el estrés y en el perfil peptídico, con el objetivo de identificar biomarcadores implicados en la supervivencia del microorganismo ante condiciones ambientales subletales. Se identificaron 4 marcadores peptídicos en el espectro de masas correspondientes a proteínas intactas. Se identificó y validó un posible marcador de estrés de C. sakazakii en m/z 3336,6. Los resultados mostraron que el choque térmico aplicado al microorganismo aumentó la expresión de chaperones como DnaK, proteínas independientes del ATP involucradas en el correcto plegamiento de proteínas y algunos factores de virulencia relacionados con la integridad de la membrana. Estas proteínas parecen desempeñar un rol relevante en el mantenimiento de la síntesis proteica como mecanismo adaptativo al estrés térmico subletal. El estudio de la resistencia de C. sakazakii a variaciones de temperatura subletales aporta información acerca de su viabilidad y sus estrategias para sobrevivir, como la generación de estados fisiológicos adaptativos o la sobreexpresión de marcadores peptídicos que puedan suponer una vía adicional de patogenicidad.